玉米穗腐引起叶枯的抗性鉴定

栾一凡, 赵众欢, 王昭, 李云梦, 喻倩, 宋云霞, 周子键, 陈甲法,孙豆豆, 景沛, 吴建宇,

(1.河南农业大学农学院,河南 郑州 450046; 2.河南农业大学生命科学学院,河南 郑州 450046)

玉米是中国第一大粮食作物,常年种植面积约4.3×107hm2[1],在国家粮食安全中发挥重要作用。玉米穗腐病是中国广泛发生的主要玉米病害,不仅影响了玉米产量,其病原菌代谢产生的毒素也影响着玉米的品质,且严重危害着人畜的健康[2-3]。玉米根腐病与茎腐病都会引起根部的茎节腐烂从而引起叶枯[4-5],叶枯是植株系统性症状之一。穗腐主要发病部位为果穗、苞叶和穗轴,主要发病症状为籽粒腐烂、穗轴松软腐烂[6]。大田生产中发现,穗腐病发生严重的地区会伴随叶枯症状的发生,叶枯无疑影响到光合作用,并引起水分与营养物质运输等障碍,穗腐叠加叶枯,玉米穗腐病危害加重。在对籽粒与穗轴接种拟轮枝镰孢进行抗性鉴定时多点发现,玉米穗腐引起叶枯症状,其中籽粒接种引起的叶枯较少而穗轴接种引起的叶枯较为严重。发病果穗、穗柄及穗位茎秆纵向剖开后,观察到拟轮枝镰孢可以由果穗经穗柄侵染至茎秆,使茎秆发生褐变,且与茎腐病剖茎法所表现的症状相似[7-8]。为了进一步了解这一病症并加深对玉米穗腐病不同组织抗性的认识,以326份骨干自交系与以抗、感自交系衍生的244份重组近交系群体为材料,建立玉米穗腐引起叶枯的抗性鉴定体系,进行抗性鉴定和抗性比较研究,从新的角度观察并解析接种穗腐对叶枯抗性的影响,筛选出兼抗穗腐和叶枯的优异抗源,服务于玉米抗病育种与生产实践。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包含玉米骨干自交系和重组近交系(recombinant inbred lines,简称RIL)群体,其中骨干自交系包含326份具有丰富遗传变异的玉米自交系,来源于中国有代表性的主要玉米种质(Reid、Lancaster、唐四平头、旅大红骨、P群)和CIMMYT的骨干自交系;RIL群体包含244个自交系,来源于高抗穗腐玉米自交系BT-1(高抗叶枯)和高感穗腐玉米自交系西502(高感叶枯),由单粒传法自交10代选育而成。病原菌为拟轮枝镰孢(Fusariumverticilloides)。

1.2 试验设计

2020年夏播,在河南焦作和郑州分别种植326份骨干自交系,从中选取179份和110份材料分别进行籽粒与穗轴接种拟轮枝镰孢并调查叶枯表型用于探索穗腐引起叶枯的接种方式。

2021年春播,在河南郑州分批种植RIL群体的亲本BT-1、西502以及CNW069、1-160、HNL132-2、NL92、CNW156、CNW147、CML162、RIL9、RIL80、RIL55共12个叶枯抗性不同的自交系,参考穗腐接种方法,探索适合叶枯的接种部位(穗柄、穗轴中部偏下和穗轴基部)、接种时期(授粉前、授粉后2 d和授粉后15 d)、接种剂量(1和2 mL)和孢子数量(5×106、5×107和5×108个·mL-1)。

2021年夏播,分别在河南鹤壁试验基地、河南农业大学许昌校区种植326份骨干自交系和244份RIL群体,并进行穗腐引起叶枯抗性鉴定。

田间试验设计采用随机区组设计,2020年夏播与2021年夏播每个材料均设置2个重复,2021年春播设置4个重复。每个重复种植1行,每行20株。田间行长为4 m,行距0.67 m,株距0.21 m。

1.3 接种鉴定体系

1.3.1 接种方法 玉米穗腐病在玉米授粉后15 d进行接种,接种前在孢子悬浮液中加入吐温80,体积分数为2 mL·L-1,其中籽粒接种选择在果穗中下部用连动注射器于籽粒处接种1 mL孢子悬浮液(5×106个·mL-1);穗轴接种选择在果穗中下部先用电钻以斜向下角度钻孔至穗轴,再用连动注射器对钻孔处接种1mL孢子悬浮液(5×106个·mL-1)[9-10]。

A:籽粒接种位置;B:穗轴接种位置;C:穗腐引起叶枯接种位置。

玉米穗腐引起叶枯抗性鉴定选择在玉米授粉后2 d进行接种,接种前在孢子悬浮液中加入吐温80,体积分数为2 mL·L-1,在果穗基部用电钻以斜向下角度钻孔至穗轴,再用连动注射器对钻孔处接种1 mL孢子悬浮液(5×106个·mL-1)。

1.3.2 抗性调查与鉴定 接种后21～28 d开始调查叶枯表型,对单株采用1、3、5、7、9五级标准进行分级鉴定,标准如表1所示,以叶枯平均发病等级代表自交系发病程度。

表1 玉米穗腐引起叶枯发病等级标准

鉴定叶枯表型后,待果穗收获并充分晾晒后,用无尘电锯将其从中间纵向剖开,以最小单位为mm的标尺测量纵向发病长度,即穗轴发病长度,鉴定穗腐抗性。

使用Microsoft Office Excel 2016进行表型数据统计和图表的绘制,QTL IciMapping进行表型数据联合分析。

1.4 抗性评价

计算2个环境下叶枯发病等级的最佳线性无偏估计值(BLUE)[11],利用参考品种法[12]将叶枯抗性分为高抗(HR),抗(R),中抗(MR),感(S),高感(HS),具体标准如表2所示,a为5个高抗自交系的叶枯平均发病等级的平均值,b为5个高感自交系的叶枯平均发病等级的平均值,d=(b-a)/8,抗感材料表型如图2所示。

表2 玉米穗腐引起叶枯抗性评价标准

左图为抗病材料,右图为感病材料。

参考玉米穗轴抗性评价标准[10],将穗轴抗性分为高抗(HR),抗(R),中抗(MR),感(S),高感(HS)。

2 结果与分析

2.1 玉米穗腐引起叶枯抗性鉴定体系的建立

2020年夏播,在观察到玉米穗腐引起叶枯的基础上(图3),对河南焦作和郑州种植的自交系在接种21～28 d后进行叶枯发病等级调查并计算叶枯平均发病等级。结果发现,穗腐病籽粒接种的自交系叶枯发病等级集中在1级,而穗轴接种的自交系叶枯发病等级主要集中于1、3、5级,整体偏抗性(图4)。这说明两种常规的穗腐病接种方法不适合进行叶枯抗性的研究,可能是接种后发病时间不足所致,因而需要改良现有接种方法,解决因鉴定时间不足而影响叶枯症状表现的问题。

从左至右4张图分别代表穗腐病感病玉米果穗表型、穗柄表型、穗位茎节表型和全株叶片表型。

左图为179份玉米自交系籽粒接种后发病等级频率分布直方图,右图为110份玉米自交系穗轴接种后发病等级频率分布直方图。

2021年春播,利用12份抗性存在差异的自交系进行接种体系的探索。首先对玉米果穗不同部位的接种方法进行研究,发现在穗柄处接种,孢子液溢出较多,且菌丝扩增较慢;在穗轴中部偏下接种,病原菌需要一定的时间到达果穗底部,也延迟了叶枯的发病时间;在穗轴基部接种,孢子液不易溢出且发病稳定,穗腐发生后,病原菌还能较快扩展至穗茎节导致组织受损从而影响到水分与营养输送,引起叶枯的发生,效果最好。其次,进行了接种时期的研究,发现在授粉前接种,果穗发病重,出现停止生长甚至坏死现象;授粉后15 d接种时,叶枯推迟,而早熟自交系的叶片衰老较快也影响了叶枯的表型调查;在授粉后2 d接种,虽然处理时果穗发育尚早,但为叶枯的发生留足了时间,效果最好。三是对菌液的接种浓度与剂量进行了研究。发现在5×106个·mL-1的基础上提高孢子数量体积分数,进行的表型调查差异不明显,而且增加接种剂量会使孢子液溢出。综合总结接种方式、接种时期、孢子数量体积分数3个方面的研究结果,把穗轴基部处理、授粉后2 d接种、接种1 mL孢子数量体积分数为5×106个·mL-1的孢子悬浮液作为穗腐引起叶枯的接种体系,以便后期进行抗性评价。

2021年夏播,利用建立的接种体系分别对河南鹤壁与河南许昌2地种植的326份骨干自交系和244份RIL群体分别进行接种鉴定,利用2个环境条件下叶枯发病指数联合BLUE值进行抗性评价后做频率分布直方图(图5)。发现鉴定同一自交系内发病较为一致,自交系间变异幅度大,且整体上近似呈现正态分布,可以进行田间的规模接种与抗叶枯鉴定。

2.2 玉米穗腐引起叶枯的抗性鉴定

2.2.1 玉米骨干自交系的抗性鉴定 对河南鹤壁与许昌两个环境下326份自交系进行接种鉴定,结果发现,高抗(HR)自交系有63份,包括CML147、CML156、CML160、CML162、CML312、CML495和CNW059等,所占比例为19.3%;抗病(R)自交系共63份,包括CML152、CML219、CML 327、CML 420、CML 27和新DH等,所占比例为19.3%;中抗(MR)自交系共100份,包括CML139、PHR58、CML141、CML180、CML80、CML422和CNW094等,所占比例为30.7%;感病(S)自交系共69份,包括吉853、4F1、掖832、CNW041、CNW167、PHJ75和CNW013等,所占比例为21.2%;高感(HS)自交系共31份,包括PB80、2FACC、LH220Ht、亲24、CNW105、MO113和PHT77等,所占比例为9.5%。极端抗性自交系的鉴定结果如表3所示。

表3 极端抗性玉米自交系抗性评价

2.2.2 玉米RIL群体的抗性鉴定 对河南鹤壁与许昌两个环境下244份RIL群体进行抗性鉴定,结果发现,高抗(HR)自交系共20份,包括RIL185、RIL24、RIL14、RIL131、RIL220、RIL55和RIL176等,所占比例为8.2%;抗病(R)自交系共66份,包括RIL91、RIL234、RIL166、RIL138、RIL71、RIL115和RIL32等,所占比例为27.1%;中抗(MR)自交系共105份,包括RIL67、RIL82、RIL94、RIL103、RIL127、RIL200和RIL219等,所占比例为43.0%;感病(S)自交系共48份,包括RIL84、RIL215、RIL34、RIL7、RIL121、RIL252和RIL267等,所占比例为19.7%;高感(HS)自交系共5份,包括RIL90、RIL64、RIL9、RIL122和RIL141,所占比例2.0%。极端抗性自交系的鉴定结果如表4所示。

表4 玉米RIL群体极端抗性自交系抗性评价

2.3 不同杂种优势群的玉米穗腐引起叶枯抗性评价

用ADMIXTURE软件对326个骨干自交系进行血缘追踪,不同杂种优势群玉米自交系的叶枯抗性结果统计如表5所示。

表5 不同玉米杂种优势群自交系的抗性评价

由表5可知,热带血缘的自交系中高抗(HR)的自交系48份,抗(R)的自交系29份,合计77份,所占比例为73.3%;P群自交系中高抗(HR)自交系9份,抗(R)的自交系2份,合计11份,所占比例为73.3%。这说明CIMMYT与P群自交系具有丰富的叶枯抗源。Lancaster类群自交系中抗(MR)的自交系17份,感(S)的自交系13份,合计30份,所占比例为76.9%;四平头类群自交系中抗(MR)的自交系11份,感(S)的自交系14份,合计25份,所占比例为86.2%;Reid类群自交系中抗(MR)的自交系10份,感(S)的自交系11份,合计21份,所占比例为72.4%。这说明来自Lancaster、唐四平头和Reid类群的自交系叶枯抗性相对较差。

2.4 穗腐引起叶枯抗性与穗腐抗性的比较及优异种质筛选

2.4.1 穗腐引起叶枯抗性与穗腐抗性的比较 对其中参试的262份骨干自交系进行叶枯抗性与穗腐抗性比较,筛选出抗性一致的自交系67份,所占比例为25.6%;而抗性不一致的自交系达195份,所占比例为74.4%。其中,有102份自交系的叶枯抗性比穗腐抗性增强了1或多个等级,93份自交系的叶枯抗性比穗腐抗性减弱了1或多个等级(表6)。同时,对185份RIL群体的自交系进行了抗性比较分析,筛选出抗性一致的自交系63份,所占比例为34.1%;而抗性不一致的自交系122份,所占比例为65.9%。其中有29份自交系的叶枯抗性比穗腐抗性增强了1或多个等级,93份自交系的叶枯抗性比穗腐抗性减弱了1或多个等级(表7)。

表6 玉米自交系穗腐引起叶枯抗性与穗腐抗性的比较

表7 玉米RIL群体自交系穗腐引起叶枯抗性与穗腐抗性的比较

2个群体包括了447份自交系,抗性一致的自交系达130份,所占比例为29.1%;而抗性不一致自交系达317份,所占比例为70.9%。穗腐抗性与穗腐引起的叶枯抗性可能存在不一样的机制。

2.4.2 兼抗叶枯与穗腐优异种质的筛选 通过对262份骨干自交系和185份RIL群体自交系进行穗腐引起叶枯抗性与穗腐抗性的鉴定,共筛选出兼抗叶枯与穗腐的优异自交系14份(表8),仅占总数的3.1%,这些优异种质既是抗性遗传研究的重点资源,也是挖掘抗病基因进行抗病育种的核心材料。追踪发现,中国种质资源中兼抗穗腐病不同组织抗性的自交系较少。因而,充分利用包括CIMMYT的种质以及其他热带、亚热带种质、地方品种,挖掘并利用优异基因资源是改良中国玉米骨干自交系综合抗性的重要途径。

表8 兼抗叶枯和穗腐的优异玉米种质

3 结论与讨论

拟轮枝镰孢是玉米穗腐病、茎腐病及根腐病的常见病原菌[13-14]。在生产实践中,叶枯是由根腐病与茎腐病发生后引起的植株系统性症状的一部分[15-16]。在河南许昌、郑州、焦作和鹤壁4个试验地田间接种拟轮枝镰孢鉴定穗腐病时观察到,部分植株出现了穗位茎节腐烂及叶枯症状,可能是拟轮枝镰孢系统侵染后,从穗轴接种点逐步扩展到穗柄及穗位茎节,造成穗位茎节维管束受损或腐烂,影响了水分与营养物质等的运输,导致叶片干枯甚至坏死[17]。在茎腐与穗腐相互关系的研究中,学者们普遍认为,系统侵染型病原菌可从发病茎基部扩展至果穗,引发穗腐病[18]。石洁[15]发现,拟轮枝镰孢可从茎腐发病茎秆到达穗部。方胄等[19]在分离玉米植株中病原菌时发现,玉米茎腐致病菌拟轮枝镰孢能够在植株体内扩增至籽粒。GAI等[20]利用荧光标记的拟轮枝镰孢侵染玉米发现,引起玉米茎腐病的拟轮枝镰孢菌在生长后期可扩展至穗部,引起穗腐病。以上研究表明,茎腐在一定程度上可以引起穗腐,但所需时间较长。本研究发现穗腐病严重时可以引起玉米植株穗位茎节的腐烂并引起叶枯,这一过程与茎腐引起玉米植株根部茎节的腐烂并导致叶枯相似[21-22]。穗腐复合引起果穗和穗位茎秆的腐烂与叶片枯死,加重了穗腐的危害,对玉米生产带来了严重的不利影响。玉米穗腐病抗性是一个复杂性状,受到籽粒、穗轴、穗茎节、叶片等多性状,拟轮枝镰孢、禾谷镰刀等多病原菌,温度、湿度等多环境及耕作制度的影响。因此,需要多学科合作,发挥各自的优势,从多角度解析其抗性机制,加强多性状抗性的利用,才能防止病害的发生与流行。

基于穗腐抗性鉴定的经验,初步进行了穗腐引起叶枯抗性鉴定体系的探索。研究发现,传统的籽粒接种与穗轴接种都不适用于叶枯抗性的鉴定。籽粒接种时,病原菌需先由籽粒突破至穗轴,再由穗轴中部扩展至基部,然后进入穗柄,最终才扩展到穗位茎节,需要较长时间;穗轴接种时,病原菌从穗轴中部扩展至穗轴基部再侵入穗柄至穗茎节,仍需要一定时间。穗腐病抗性鉴定时一般在授粉15 d后接种,接种30 d后观察表型,最后引起叶枯的时间相对不足。本研究通过授粉后提前接种、接种部位下移到果穗基部的方法较好地解决了这一问题。通过连续3 a的田间观察及2 a的大田试验,初步建立了玉米穗腐引起叶枯的接种体系和抗性鉴定体系,在河南鹤壁与许昌2个不同环境下对326份自交系以及244份RIL群体进行抗性鉴定,发现在叶枯性状上存在较大变异,可能的原因一是不同材料的穗柄长度存在差异,这在客观上影响病原菌入侵至茎节的距离与时间;二是不同材料间穗轴、穗柄及茎秆的维管束结构存在差异,这对病原菌的侵染存在一定的影响[23-25]。进而对其中262份骨干自交系和185份RIL群体的穗腐引起叶枯抗性与穗腐抗性进行比较研究,发现70.9%的自交系抗性表现不一致,存在一定的差异。宋杰等[26]对玉米穗轴、穗柄和茎节的横向剖开观察,发现玉米穗轴中小维管束数目远小于穗柄和茎秆,而大维管束数目与穗柄相似、但远小于茎节,穗腐是果穗接种后病原菌向上向下侵染所引起的,而叶枯是果穗接种后病原菌向穗柄及其穗茎节侵染所致,二者可能存在不一样的抗性机制。基于RIL群体进行的连锁分析结合自然群体进行的关联分析的抗性遗传研究结果初步验证了表型鉴定的结果。

与玉米根腐病与茎腐病相比较,穗腐病发生较轻的地块以及籽粒接种引起的穗腐病观察到的叶枯症状相对较少,而发病较重的地块叶枯症状较为明显,尤其在利用穗轴接种引起的穗腐病后期发生的叶枯频次已远不是小概率或随机事件。那么叶枯是否由钻孔时造成伤口,其他病原菌侵入所致,或者是否因生理性衰退或高温等环境因素造成的。如果是杂菌污染或是环境因素引起的叶枯,其在不同自交系间或同一自交系内是随机发生的,环境方差大,抗感自交系的表现也没有规律。本研究一是通过田间跟踪观察,观察到了由于病原菌侵染导致穗轴腐烂、穗部茎节变褐腐烂、叶片枯死的发病过程;二是通过授粉后提前接种、接种部位下移到果穗基部的方法较好地解决时间不足的问题,初步建立了玉米穗腐引起叶枯的接种体系和抗性鉴定体系;三是通过3 a的学习与实践,在表型调查时排除了由虫蛀、高温、折断、倒伏、锈病等因素引起的叶枯,且通过连续观察排除了因叶片生理衰老或其他病原菌造成的叶枯,观察到存在遗传多样性的关联群体在叶枯症状上表现出丰富的变异而在同一自交系内表现较为一致,降低了环境方差,因而关联群体与RIL群体的遗传方差较大,一定程度上验证了抗性鉴定体系的有效性,从穗茎节受损以及叶枯等新的视野加深了对玉米穗腐病的认识。虽然本研究连续跟踪了穗轴腐烂、穗部茎节变褐腐烂、玉米植株叶片枯死的连续过程,其发病引起叶枯的植株系统性症状仍需要在室内以拟轮枝镰孢菌GFP荧光标签表达株系观察其侵染过程来验证。另一方面,研究克隆的主效QTL以及关键候选基因正在进行图位克隆与功能验证,从而深入探索穗腐引起叶枯抗性的分子调控机制,建立抗性基因分子标记选择体系以及全基因组选择体系,进而创新种质资源,直接服务于玉米抗病育种,并最终为保障国家的粮食安全服务。