黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠TLR4-MyD88信号通路的影响*

刘雨婷,刘晓庆Δ,武琳琳

西北妇女儿童医院:1.药剂科;2.妇女保健科,陕西西安 710061

子宫内膜异位症是内膜细胞在子宫内膜以外的位置种植的疾病,是妇科常见疾病[1]。该病多发生于育龄期女性,其主要症状包含慢性盆腔痛、异位结节、不孕、痛经、月经异常等,是一种需要终身治疗的慢性疾病,对女性的身体健康造成了诸多不利影响[2-3]。目前临床对子宫内膜异位症的治疗主要依托于药物与手术,但仍需寻找更多有效药物进行治疗。黄芪甲苷提取自黄芪的根,属于黄芪的活性物质,具有抗炎、增强免疫及减弱癌细胞增殖、转移的作用[4]。闵治红等[5]研究显示,黄芪可调控患者子宫内膜间质细胞趋化因子。黄芪甲苷可抑制黑色素瘤B16细胞[6]、受损内皮细胞[7]的增殖。子宫内膜异位症虽属良性疾病,但具有恶性增殖的性质[8]。炎症反应是子宫内膜异位病灶中的重要特征[9]。故本研究推测黄芪甲苷可能通过发挥抗炎和抑制细胞增殖的作用影响子宫内膜异位症的进展。Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子(MyD88)的活化可激活下游核因子(NF)-κB,进而参与多种细胞因子的活化,在子宫内膜细胞的增殖中发挥作用[10]。TLR4-MyD88信号通路的激活可促进子宫内膜异位症病灶异位细胞的增殖和侵袭,抑制该信号通路可减轻子宫内膜异位症大鼠的疼痛度[11-12]。黄芪甲苷能否对子宫内膜异位症大鼠发挥治疗作用及其对TLR4-MyD88信号通路的调控作用尚且未知,本研究将对此展开分析,现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂、仪器 SPF级无交配史SD大鼠(雌性)50只,购自陕西省食品药品检验研究院,许可证号:SYXK(陕)2018-002,常规饲养,体质量180～220 g,自然光照,温度(22±2)℃。适应性喂养7 d后开始实验。黄芪甲苷购自成都德思特生物技术有限公司;大鼠孕酮(P)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自北京博蕾德生物科技有限公司(批号:AR E-8700);大鼠雌二醇(E2)、大鼠卵泡刺激素(FSH)、大鼠黄体生成素(LH)、大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、大鼠白细胞介素(IL)-6、大鼠IL-8 ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司(批号:ml002871、ml059034、ml470613、ml002859、ml102828、ml002885);BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝生物公司(批号:PC0020);兔抗鼠TLR4、MyD88、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、NF-κB、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),以及辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔均购自美国Abcam公司(批号:ab217274、ab219413、ab194726、ab16502、ab8245、ab6721)。酶标仪购自Molecular Devices 美谷分子仪器(上海)有限公司。光学显微镜(光镜)购自上海豫光仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1大鼠子宫内膜异位症模型的建立以及分组 参考文献[13],建立大鼠子宫内膜异位症模型,大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,麻醉后将大鼠固定至鼠板上,暴露大鼠腹部,备皮、消毒,开腹,找到子宫,分离右侧子宫,在距左侧卵巢约1 cm处结扎肠系膜上的血管,再结扎右侧子宫宫颈处两端,剪取中间子宫体2 cm,将剪下的组织在生理盐水中培养,沿系膜部位将组织纵行剪开,剪取两段内膜组织片段,约4 mm×4 mm,将子宫内表面上皮与腹壁相贴合。术后缝合皮肤,注射抗生素防止感染。4周后开腹,若出现移植物体积增大、液体聚集,出现白色透明或暗红色小囊肿则为造模成功。

将造模成功的40只大鼠按随机数字表法分为模型组和黄芪甲苷低、中、高剂量组,每组10只。另取10只大鼠仅切开皮肤,不移植子宫内膜,作为对照组。黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予20、40、80 mg/kg黄芪甲苷灌胃处理(二甲基亚砜溶解并添加生理盐水至所需浓度),连续给药28 d;对照组、模型组以等量生理盐水代替。

1.2.2子宫内膜组织收集以及处理 末次给药结束后给予戊巴比妥钠麻醉大鼠,眼静脉采集血液1 mL,对大鼠进行开腹,取腹壁移植物,测量移植物长、宽、高,并计算体积,对照组收集子宫,将标本冲洗干净,吸去水分,模型组等其他组开腹取腹壁移植物,将组织分为2部分,一部分进行苏木精-伊红(HE)染色法检测(多聚甲醛固定),另一部分于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3血清E2、P、LH、FSH、TNF-α、IL-6、IL-8水平检测 分离获得血清,通过相应ELISA试剂盒测定血清中E2、P、LH、FSH、TNF-α、IL-6、IL-8水平。

1.2.4HE染色 将固定的子宫内膜组织进行脱水,石蜡包埋,切片,并进行HE染色,中性树脂封片,光镜下观察子宫内膜组织病理变化。

1.2.5蛋白质印迹法检测子宫内膜组织中TLR4-MyD88信号通路蛋白表达 提取各组细胞总蛋白,对蛋白定量(BCA试剂盒),进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,分离蛋白转到PVDF膜,封闭,加入兔抗TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000),4 ℃过夜,加入HRP偶联的羊抗兔二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,电化学发光(ECL)显色,测定TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB的蛋白表达情况。

2 结 果

2.1黄芪甲苷对各组大鼠异位子宫内膜体积的影响 与对照组相比,模型组大鼠异位子宫内膜体积增大(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠异位子宫内膜体积缩小(P<0.05),且呈剂量依赖性(F=119.978,P<0.001)。见表1。

表1 各组大鼠异位子宫内膜体积比较

2.2黄芪甲苷对各组大鼠血清性激素的影响 多组间FSH水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,模型组大鼠血清E2、P、LH水平升高(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清E2、P、LH水平降低(P<0.05),且存在剂量依赖性(F=298.466、104.096,F=81.817,均P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清E2、P、LH、FSH水平

2.3黄芪甲苷对各组大鼠血清炎症因子的影响 与对照组相比,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05),且呈剂量依赖性(F=96.970、59.955、63.928,均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比较

2.4黄芪甲苷对各组大鼠子宫内膜组织的影响 对照组大鼠子宫内膜生长良好,结构完整,清晰可见,上皮内细胞核丰富,血管、间质正常;模型组大鼠可见移植内膜生长,被覆柱状上皮,间质较多,可见炎性浸润;黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组移植内膜与模型组相比变少,生长不完整,腺体减少或消失,腺上皮萎缩。见图1。

注:A为对照组;B为模型组;C为黄芪甲苷低剂量组;D为黄芪甲苷中剂量组;E为黄芪甲苷高剂量组。图1 各组大鼠子宫内膜组织病理(HE染色,×200)

2.5黄芪甲苷对各组大鼠TLR4-MyD88信号通路的影响 与对照组相比,模型组大鼠子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平降低(P<0.05),且存在剂量依赖性(F=149.634、121.363、117.281、134.361,均P<0.05)。见表4、图2。

注:A为对照组;B为模型组;C为黄芪甲苷低剂量组;D为黄芪甲苷中剂量组;E为黄芪甲苷高剂量组。图2 各组大鼠子宫内膜组织TLR4-MyD88信号通路蛋白表达电泳图

表4 各组大鼠子宫内膜组织TLR4-MyD88信号通路蛋白表达情况

3 讨 论

子宫内膜异位症是子宫内膜存在的内膜细胞扩散至子宫内膜以外种植的疾病,属于妇科常见疾病[14]。育龄期妇女易患此病,子宫内膜种植学说是当今的主流发病机制观点[15]。异位内膜细胞的持续增殖可加速子宫内膜异位症的疾病进程[16]。组织细胞迁移是子宫内膜异位病灶病理形成的前提条件,调节细胞迁移可能影响内膜组织细胞在异位的种植与存活,从而影响子宫内膜异位病灶的形成[17]。

黄芪甲苷是提取自黄芪根中的活性物质,药理研究表明,黄芪甲苷具有增加免疫力、抗炎、抗肿瘤的作用[4]。黄芪甲苷可抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖与迁移。杨红等[18]研究显示,黄芪甲苷可抑制HL60细胞增殖,并促进细胞凋亡,在治疗急性髓系白血病中发挥重要作用;刘钰等[19]研究显示,黄芪甲苷可促进高糖受损人内皮祖细胞迁移;张振飞等[20]研究显示,黄芪甲苷可抑制A549(非小细胞肺癌细胞)细胞增殖与迁移。张冀宁等[21]研究显示,趋化因子受体CXCR1、CCR5在子宫内膜异位症中发挥重要作用,黄芪可调控CXCR1、CCR5水平。韩晓波[22]通过数据挖掘分析子宫内膜异位症用药规律,发现黄芪是其中最常用的药物。因此,推测黄芪甲苷对子宫内膜异位症可能具有治疗作用。

本研究中,黄芪甲苷可明显缩小病灶,改善病灶组织形态,模型大鼠移植的内膜组织被覆柱状上皮结构清晰,存在炎性浸润,拥有较多腺体,黄芪甲苷可减少炎性浸润与腺体,病理改变减轻,提示黄芪甲苷具有治疗子宫内膜异位症的作用。子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病,体内激素水平反映了内膜的生长情况。有研究显示子宫内膜异位症患者的E2、LH、P水平升高,内膜容受度较差,内膜厚度较薄[23]。本实验中经黄芪甲苷处理后,子宫内膜异位症大鼠血清E2、LH、P水平降低,提示黄芪甲苷可抑制大鼠性激素的分泌,进而治疗子宫内膜异位症。

子宫内膜异位症是一种低度炎症性疾病[24],其特征是促炎性细胞因子如IL-6、IL-8和TNF-α的产生增加,可以促进子宫内膜细胞的增殖和黏附[25-26]。本研究中模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平显著高于对照组,且经黄芪甲苷处理后,大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平降低,提示黄芪甲苷可控制子宫内膜异位症大鼠炎症反应,控制异位灶的形成。

TLR4是机体固有免疫受体,诱发炎症反应与获得性免疫反应,具有免疫调节作用,在多种疾病中发挥作用,可通过MyD88依赖性通路诱导炎症介质,激活NF-κB,参与疾病的炎症反应[27]。有研究显示,TLR4-MyD88信号通路可参与子宫内膜异位症病灶内细胞增殖与迁移的调控,且抑制TLR4-MyD88信号通路能够阻碍异位病灶细胞的增殖和侵袭,从而减缓子宫内膜异位症进展[11,28]。MARCHIONNI等[29]研究显示,TLR4是子宫内膜异位症发病机制中一个较好的候选者。王芳等[30]研究显示NF-κB在子宫内膜异位症大鼠异位病灶的生长中发挥作用。本研究中,模型组大鼠子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高,经黄芪甲苷处理后其水平降低,提示黄芪甲苷可抑制TLR4-MyD88信号通路的激活。黄芪甲苷可能通过抑制TLR4-MyD88通路激活发挥对子宫内膜异位症的治疗作用,但相应机制仍有待进一步探讨。

综上所述,黄芪甲苷可抑制子宫内膜异位症大鼠异位病灶生成,减轻炎症反应和降低性激素水平,抑制TLR4-MyD88信号通路激活,且呈剂量依赖性。