TLR4、TREM1 在肺曲霉菌病患者血清中的表达水平及其诊断价值

刘佳佳 陈思琪 崔鲂

肺曲霉菌病(pulmonary aspergillus disease,PA)是由曲霉菌侵入肺组织所引起的深部真菌感染性疾病,其中危害最严重的类型是侵袭性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillus,IPA),病程进展快,病死率高,常发生在免疫抑制的病患中[1]。目前诊断PA的依据缺乏一定客观性或获取结果耗时久,尤其是IPA病情进展迅速,常规检测手段易延误治疗时机[2-4]。Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)作为天然免疫模式识别受体,参与了烟曲霉感染宿主免疫防御[5-6]。髓样细胞触发受体1(triggering recepter expressed on myeloid cell 1 ,TREM1)是先天免疫效应细胞的模式识别受体之一,在烟曲霉的识别中发挥作用,可放大TLR4炎症信号[7-8]。因此,本研究检测TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的表达情况并探究其诊断价值,以期为早期临床诊断曲霉菌感染提供一定参考价值。

资料与方法

一、 一般资料

经本院医学伦理委员会审批(伦理审查批号:2022-K254),选取2021年9月至2023年3月在重庆医科大学附属第一医院确诊为肺曲霉菌病患者30例为研究对象(研究组),选取研究组中接受抗真菌药物治疗214天的患者16例为药物治疗组;同期本院健康体检者 25例作为健康对照组,本院确诊为肺部感染(非曲霉菌)患者30例为肺部感染对照组。 研究组纳入标准:(1)均符合肺曲霉菌病诊断标准[2,9]。(2)患者年龄≥18岁。(3)临床资料完整。(4)签署知情同意书。排除标准:(1)合并败血症、脓毒症、克罗恩病和溃疡性结肠炎等慢性炎症[10]。(2)合并心肌梗死、感染性心内膜炎、自身免疫性疾病如银屑病、类风湿关节炎等[11]。健康对照组纳入标准:(1)无发热感染等症状。(2)年龄≥18岁。(3)心、肝、肾功能正常。(4)白细胞计数正常。肺部感染对照组纳入标准:(1)符合肺部感染诊断标准。(2)无曲霉菌感染的临床及病原学检测依据。(3)年龄≥18岁。

二、 酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 检测血清中TREM1、TLR4水平

肺曲霉菌病患者、健康体检者、肺部感染(非曲霉菌)患者于入院当天、获得诊断当天、体检当天空腹抽取静脉血5mL,室温静置1h,3000r/min离心10min,上清备用。严格按照人TREM1、TLR4 ELISA试剂盒(华美生物 cusabio 公司,产品编号分别为:CSB-E04836h,CSB-E12954h)说明书检测血清中TREM1、TLR4水平。

三、使用AVIOS高通量流式细胞仪检测血清Th1/Th2/Th17型相关细胞因子浓度(包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ)

肺曲霉菌病患者、健康体检者、肺部感染(非曲霉菌)患者于入院当天、获得诊断当天、体检当天、肺曲霉菌患者服用抗曲霉菌药物治疗14天[12]后,空腹抽取静脉血5mL,室温静置1h,3000r/min离心10min,上清备用。严格按照人Th1/Th2/Th17亚群检测试剂盒(江西赛基生物技术有限公司)使用说明书检测血清中Th1/Th17型相关细胞因子浓度。

四、统计学分析

结 果

一、基线资料

选取2021年9月至2023年3月在重庆医科大学附属第一医院确诊为肺曲霉菌病患者30例为研究对象(研究组),男 20例、女10例,年龄≥18岁、平均年龄(62.60±13.95)岁(见表1); 同期本院健康体检者 25例作为健康对照组,男16例、女9例,年龄≥18岁、平均年龄(62.92±10.32)岁; 本院确诊为肺部感染(非曲霉菌)患者30例为肺部感染组,男24例、女6例,年龄≥18岁、平均年龄(70.13±19.99)岁。各组间性别、年龄差异无统计学意义(χ2=0.043,F=2.198,P>0.05),具有可比性。

二、研究组、肺部感染组、健康对照组血清TREM1、TLR4水平情况

与健康对照组、肺部感染组相比较,研究组血清中TREM1、TLR4水平均升高(P<0.05)。肺部感染组与健康对照组血清中TREM1、TLR4水平相比较,差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

三、血清TREM1、TLR4水平对肺曲霉菌病患者的诊断价值

表1 研究组临床资料

表2 研究组、肺部感染组、健康对照组血清中TREM1、TLR4水平比较

通过ROC曲线探究血清TREM1、TLR4水平对肺曲霉菌病患者的诊断价值。ROC曲线显示,血清TREM1水平预测肺曲霉菌病的ROC曲线下面积为0.753(95%CI:0.608～0.897),截断值为251.387 ng/L,其敏感度为56.67%,特异度为84.21%,准确度为 67.35% ;血清TLR4水平预测肺曲霉菌病的ROC曲线下面积为0.865(95%CI:0.761～0.969),截断值为6.707 ng/mL,其敏感度为76.67%,特异度为89.47%,准确度为 81.63% ;两者联合预测肺曲霉菌病的ROC曲线下面积为0.898(95%CI:0.810～0.986),其敏感度为90.00%,特异度为78.95%,准确度为85.71%(见图1)。血清TLR4水平与TREM1+TLR4 ROC曲线下面积差异无统计学意义(Z=0.944,P=0.345);与血清TREM1水平相比,TREM1+TLR4 ROC曲线下面积升高(Z=2.089,P=0.037)。血清TREM1水平敏感度、准确度均低于TREM1+TLR4(P<0.05)(见表3)。

图1 血清TREM1、TLR4水平预测肺曲霉菌病的ROC曲线

表3 血清TREM1、TLR4水平及两者联合对肺曲霉菌病诊断价值的敏感度、特异度、准确度比较(%)

四、研究组、肺部感染组、健康对照组血清炎性因子比较

健康对照组与研究组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比较差异有统计学意义(P<0.05);健康对照组与肺部感染组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比较差异有统计学意义(P<0.05);肺部感染组与研究组血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表4);研究组用药前与用药后血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17水平比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表5)。

表4 研究组、肺部感染组、健康对照组血清炎性因子比较

表5 研究组用药前后血清炎性因子比较

讨 论

PA患者在感染早期,其外周循环中即会出现各种炎症因子的改变,可作为早期诊断备选生物标志物。且血清炎症因子的检测具有廉价、简单,可操作性强、研究价值高,应用前景广等优点,值得进一步研究探索[15-16]。TREM-1在含有曲霉菌肉芽肿中有表达,提示该受体可能参与宿主的抗真菌反应;进一步的研究表明,TREM-1在真菌感染的肺中调节对烟曲霉的免疫应答,明确揭示了TREM-1在真菌感染中的作用[17-18]。在曲霉菌感染患者体内,TLR4能够识别受损组织和坏死细胞释放的内源性病原分子,进而促进炎症反应[5,19];而TREM-1作为烟曲霉炎症反应的重要调节因子;可调节对感染的先天和适应性免疫反应,从而协同和放大TLR4介导的信号通路,诱导炎症因子产生,加强炎症反应过程[20-23];有研究指出TREM-1激活后与TLR4协同作用,通过激活核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、酪氨酸磷酸化来促进促炎细胞因子的产生,如 白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL- 12p40和肿瘤坏死因子α( tumor necrosis factor alpha,TNF-α )等[24-25]。因此本研究通过检测血清TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的表达水平,以期早期发现肺曲霉菌感染患者,为患者治疗提供一定参考依据。在本研究中肺曲霉菌病患者血清中TREM1、TLR4水平与健康对照组、肺部感染组相比升高,表现出高表达,且肺部感染组与健康对照组间差异无统计学意义(见表2);提示曲霉菌侵入肺组织后诱发机体炎症反应,进而影响TREM1、TLR4水平。Bernal-Martínez L.等[7]研究中指出TREM1水平在IPA患者体内是升高的,与本研究结果相符 ;并通过进一步研究表明,患者血清中TREM1水平高于251.387ng/L、TLR4水平高于6.707 ng/mL在临床上应该受到重视,提示患者感染肺曲霉菌病的概率升高;而且TREM1+TLR4 ROC曲线下面积高于血清TREM1 ROC曲线下面积,敏感度、准确度高于血清TREM1敏感度、准确度(见图1、表3)。表明两者联合诊断可使诊断价值更高,综合两者指标对于提前诊断肺曲霉菌病更有价值。

曲霉菌入侵肺组织引起的免疫反应:呼吸道上皮细胞和吞噬细胞通过模式识别受体(PRRs) 识别曲霉菌表面上多种病原体相关分子模式(PAMPs),两者识别后曲霉菌抗原被树突状细胞处理并迁移到局部淋巴结,随后将真菌肽呈现给曲霉菌特异性的原始CD4+T细胞,并诱导其分化为辅助性T细胞亚群1(help T cell 1,Th1)细胞,辅助性T细胞亚群2(help T cell 2,Th2)细胞,辅助性T细胞亚群17(help T cell 17,Th17)细胞,这些效应细胞进一步分泌细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17等)来对抗曲霉菌感染[26-27]。中性粒细胞(Neutrophilicgranulocyte ,NEU)在机体对抗曲霉菌感染中也扮演着重要角色,由肺泡巨噬细胞或其他细胞(如上皮细胞、内皮细胞、NK细胞及树突状细胞)产生的前炎因子介导募集,通过氧化及非氧化途径杀死出芽的烟曲霉孢子及菌丝[28]。因此本研究通过检测肺曲霉菌病血清炎症细胞因子水平来探究上述指标能否为曲霉菌感染的早期诊断和治疗提供临床依据。有研究指出,IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平在曲霉菌感染早期升高,IL-2、TNF-α、IFN-γ由Th1细胞分泌,主要介导细胞免疫应答,增加机体对曲霉菌的抵抗力;IL-4、IL-6、IL-10由Th2细胞分泌,主要介导体液免疫,抑制Th1型淋巴细胞介导的免疫应答;Th1、Th2细胞之间的平衡共同维护机体免疫功能正常状态[29]。IL-17由Th17细胞分泌,而Th17细胞在IPA中的具有防御和破坏双重作用,因患者的免疫状态、免疫反应细胞、模式受体的不同而出现差异[30]。本研究中肺曲霉菌病患者血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平均显著高于对照组,表明曲霉菌侵入机体后,激活机体免疫反应,诱导多种炎症细胞因子的分泌;肺部感染组与研究组相比较患者血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平差异无统计学意义,肺部感染组上述炎性因子水平均高于健康对照组,差异有统计学意义;进一步研究表明肺曲霉菌病患者抗曲霉菌药物治疗14天后的血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17水平与抗曲霉菌药物治疗前相比均显著降低,表明抗曲霉菌药物治疗两周后,患者炎症因子水平降低。故与其他病原体引起的肺部感染相比较,肺曲霉菌病患者血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平变化无特异性;而TREM1、TLR4在肺曲霉菌病患者血清中的变化具有特异性,故对于肺曲霉菌病的诊断具有一定价值。因肺曲霉菌病的早期诊断比较困难,在疾病早期大多提前采取经验性用药,故研究组可收集的标本量较少,并且目前关于TREM1和TLR4在肺曲霉菌病中的研究较少,所以本研究的结果仅作为临床早期诊断肺曲霉菌病的一项参考指标,还需进一步扩大样本量来验证其诊断价值。

结 论

肺曲霉菌病患者血清中TREM1、TLR4水平升高,对临床早期诊断肺曲霉菌病具有一定参考价值,且两者联合诊断可使诊断价值更高;血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ、WBC、NEU水平在肺曲霉菌病患者体内早期升高,可以反映肺曲霉菌病患者抗曲霉菌药物治疗的效果。本研究还存在一定局限性,未能动态监测上述指标在病程中的变化,而且还受到样本例数的限制,因此扩大样本量、动态监测上述指标变化是本研究接下来的研究重点。