支气管肺泡灌洗液宏基因组二代测序在非中性粒细胞减少肺曲霉感染中的诊治价值

周群 费黎明 尤青海

当前,非中性粒细胞减少肺曲霉感染呈上升趋势[1],且因其临床表现无特异性,很难实现及时诊治[2]。因此,认识该菌感染的特点和多样性,评估易感群体,早期进行有效干预极为重要。迄今,确诊肺曲霉感染的方法仍依赖于病理,但耗时较长[3]。传统病原学方法费时且检出率低。基于高通量测序的宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)因其快速循环和高敏感性被认为是有前景的微生物鉴别技术[4]。前期关于mNGS的研究多集中在发现病原体上[5]。有研究阐明,在诊断肺部真菌感染方面,mNGS较传统检测技术有更高的敏感性[6-7],但仍缺乏真菌感染的临床经验,尤其在曲霉感染方面。据此,该文针对真菌感染领域进行了回顾性研究,探索支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的mNGS在非中性粒细胞减少肺曲霉感染中的诊断效能及对临床治疗的指导价值。

资料与方法

一、临床资料

收集2021年11月至2022年12月入住安徽医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科(含内科ICU病区)32例非中性粒细胞减少患者的临床资料,其BALF的mNGS示真菌。两位资深临床医师根据宿主因素、临床特征、胸部CT、实验室指标及治疗反应评估是否为肺曲霉感染,最终17例被评估为肺曲霉感染,15例为非肺曲霉感染。以下为排除标准:(1)年龄<18岁;(2)中性粒细胞减少(中性粒细胞绝对计数<1.5×109/L);(3)未做BALF的mNGS;(4)病历资料不完整。本研究经安徽医科大学第一附属医院临床医学研究伦理委员会审查批准(批件号:PJ2023-02-42)。

二、研究方法

1 标本收集

BALF标本由安徽医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科专业的气管镜医师采集。利多卡因局麻后,根据胸部CT选择取样位置,20mL生理盐水灌入目标段支气管,重复3次,利用负压回收BALF入无菌痰液收集器。为避免污染,样本的前20mL被舍弃,剩余标本送检mNGS、传统病原学(革兰染色、抗酸染色、普通细菌培养+药敏、真菌培养等)及半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)试验。

2 mNGS检测

收集的BALF标本委托予果生物科技有限公司进行mNGS检测。具体程序包括提取样本核酸、构建文库、对样本微生物进行核酸测序、分析比对数据、报告可疑致病微生物。

三、统计学分析

结 果

一、临床资料特征

回顾性分析32例非中性粒细胞减少的患者,17例纳入肺曲霉感染组,15例归为非肺曲霉感染组。两组的性别、年龄和基本临床资料构成相似。临床表现方面,肺曲霉感染组呼吸音异常16例(94.1%),咳嗽12例(70.6%),胸闷/呼吸困难12例(70.6%),但较非肺曲霉感染组比较差异无统计学意义。咯血/痰血多见于肺曲霉感染组,两组比较有统计学差异(P<0.05)。肺曲霉感染组12例(70.6%)患者存在营养不良,居潜在疾病首位。肺曲霉感染组患者免疫低下情况较非肺曲霉感染组发生率高,且在全身应用皮质类固醇激素方面明显高于非肺曲霉感染组(P<0.05)。肺曲霉感染组胸部CT表现上17例(100.0%)均为多发病变,14例(82.4%)表现为双肺浸润,13例(76.5%)可见斑片状阴影。而曲霉感染较特异的新月征和晕征在两组CT表现中均未显现。两组实验室指标比较差异无统计学意义(见表1)。

二、 mNGS与传统病原学方法阳性率的比较

32例非中性粒细胞减少患者中,mNGS检出32例(100.0%),传统病原学方法检出16例(50.0%),mNGS的阳性率明显高于传统病原学方法(P<0.001)。无论肺曲霉感染组还是非肺曲霉感染组,mNGS的阳性率均较传统病原学方法明显增高(P<0.05)(见表2)。

聚焦肺曲霉感染组BALF的mNGS、培养和GM试验,发现三组间有明显差异(P<0.001)。mNGS组的阳性率均明显高于培养组及GM试验组(P均<0.001),而培养组和GM试验组比较无明显差异(P>0.05)(见表3)。

三、非中性粒细胞减少肺曲霉感染组病原体分布

混合感染在非中性粒细胞减少肺曲霉感染组较常见。(图1)描述了肺曲霉感染组BALF的mNGS中共病原种类分布。该方法对共病原的鉴定效果令人满意(94.1%),其中曲霉-细菌-其他真菌-病毒混合感染最多见(23.5%)。共病原中最常见的细菌是铜绿假单胞菌,真菌占首位的是白色念珠菌,最多见的病毒是人类疱疹病毒1型和人巨细胞病毒(图2),提示应加强对肺曲霉感染患者混合感染的防治。

图1 肺曲霉感染组BALF的mNGS中共病原种类分布(n=17)

图2 肺曲霉感染组BALF的mNGS中共病原分布(n=17)

四、BALF的mNGS对非中性粒细胞减少肺曲霉感染抗菌治疗的指导作用

(表4)显示了17例非中性粒细胞减少肺曲霉感染患者的抗菌治疗记录。根据mNGS结果,88.2%的患者改变了抗菌治疗方案,52.9%的患者调整了抗菌谱,76.5%的患者开始使用抗曲霉菌药物。需注意11.8%的患者治疗方案无变化,因其前期已经验性抗曲霉治疗。这其中跟踪了2例非中性粒细胞减少肺曲霉感染患者抗曲霉治疗前后mNGS中曲霉序列数的动态改变。1例抗曲霉治疗1周及2周后复查mNGS未见曲霉菌,但患者症状未消失,炎症指标仍高,结合临床继续抗曲霉治疗。另1例患者抗曲霉治疗半月后mNGS未见曲霉菌,但患者症状未改善且炎症指标及GM试验均高,故继续抗曲霉治疗。1月后复查再现曲霉菌,但其序列数显著降低,炎症指标明显好转,GM试验正常,综合考虑继续予抗曲霉治疗10天后停药。

表1 患者的临床特点、实验室指标及影像特征

表2 mNGS和传统病原学方法阳性率比较[n(%)]

表3 肺曲霉感染组BALF的mNGS、培养和GM试验阳性率比较[n(%)]

表4 mNGS对非中性粒细胞减少肺曲霉感染抗菌治疗的指导作用[n(%)]

讨 论

肺曲霉感染常发生于中性粒细胞减少等免疫缺陷宿主,但在非中性粒细胞减少的重症患者中[8],肺曲霉感染比例攀升,因缺乏特异性临床表现及早期精准的诊断手段,其病死率竟高于中性粒细胞减少患者[9]。迄今为止,用于肺曲霉感染的微生物学分析包括真菌涂片和培养、GM试验、PCR、曲霉菌属特异性免疫层析侧流装置试验。其中GM试验建议送检BALF标本,其阳性高度倾向肺曲霉感染,阴性也有重要的排除价值[10],而血清GM试验诊断效能偏低[11]。近期研究显示,一种可溶性的识别受体正五聚蛋白3的多态性和曲霉的易感性呈正相关[12]。然而,这些检测对肺曲霉感染的恰当初始治疗和改善预后的指导作用有限。mNGS是一种新的微生物诊断方法,其微生物学适应证包括临床怀疑新发病原体或特殊病原体感染;传统病原学方法检测出的病原体不能完全解释临床表现,疑似合并存在其它病原体感染;临床怀疑感染,但传统病原学方法未能检测出病原体,经验性抗感染治疗疗效欠佳;传统病原学方法发现病原体,但临床表现高度怀疑该病原体出现特殊的毒力表型。同时mNGS可通过发现菌种特异性的耐药基因解决部分耐药问题[13]。mNGS对曲霉菌有较高的诊断价值。目前关于mNGS与肺曲霉菌的研究甚少[14-16]。这些研究中,Chen等人[14]和Zhang等人[15]报道了mNGS在诊断曲霉菌和耶氏肺孢子菌共同感染中的应用,Zhang等人[15]和He等人[16]报道肺曲霉感染患者存在皮质类固醇治疗的皮肌炎、COPD和哮喘等合并症,这与我们的结果是一致的。

本研究回顾性评价了BALF的mNGS在非中性粒细胞减少肺曲霉感染中的诊断效能。比对临床资料发现,与非肺曲霉感染组相比,咯血/痰血更多见于肺曲霉感染组,这与曲霉菌易侵犯血管引起出血或渗血有关,部分病人可出现大咯血窒息,故对有咯血或痰血的曲霉患者需提高警惕。肺曲霉感染组患者在全身应用皮质类固醇类药物方面明显多于非肺曲霉感染组,说明曲霉易感染免疫状态较差的患者,故对应用激素、免疫抑制剂或合并慢性病的患者需加强曲霉菌检测,警惕合并曲霉感染。

本研究通过对BALF中几种检测手段的比较发现mNGS的检测效能明显优于传统病原学方法,BALF的mNGS较培养及GM试验的诊断阳性率均高,且曲霉菌在核酸提取过程中属于较难破壁微生物,不易被检出,故即使检出序列数低仍提示其为致病菌可能[13],说明mNGS是一种可信度较高的检测技术。mNGS相对于其他微生物检测方法的另一个优势是鉴别的病原谱较广,能同时鉴定出细菌、真菌及病毒等病原体,特别在少见菌及苛养菌的鉴别中更显优势。这项技术对混合感染或特殊感染的患者尤其获益,故临床诊疗中出现经验性治疗或据传统病原学方法抗感染治疗失败时,可通过完善mNGS检测排查有无混合感染或特殊感染的可能。当然,mNGS检测的是病原核酸,并非病原微生物,故对检出的多种病原体需综合判断其致病性,避免造成抗菌药物的滥用而诱导其耐药。mNGS无异常时还可辅助诊断肺部非感染性疾病,但仍需警惕原始样本量少或病原微生物存在破壁困难造成的假阴性可能,必要时需复测mNGS或联合其他病原学检测手段联合排查。再者,mNGS技术能有效指导抗菌治疗[17-18]。在本研究中,76.5%患者初始的抗感染治疗方案均未经验性覆盖真菌,而是依据mNGS结果开始抗曲霉治疗。2例患者动态监测的mNGS结果提示,BALF中曲霉菌在抗曲霉治疗中虽可能短暂转阴,但仍不能松懈,需结合临床表现及相关实验室指标综合判断是否需继续抗曲霉治疗,否则曲霉感染仍有再次加重的风险,抗曲霉治疗需长疗程进行。故mNGS是诊断和精准抗曲霉治疗的一项有利技术。

本研究存在以下不足:首先,这是单中心回顾性研究,因此内在偏倚不可避免。目前BALF的mNGS在非中性粒细胞减少肺曲霉感染中的研究很少,迫切需要多中心前瞻性大样本研究。其次,由于缺乏对mNGS的普遍一致性解读,故判定mNGS报道的微生物结果为感染还是定植菌,最终还必须经由熟悉微生物学知识的临床专业人员参考临床表现及其他化验检查进行归类。最后,mNGS虽然高效,但高成本和高技术要求限制了其在临床的广泛应用。但mNGS对不能解释的和严重的肺炎是一种有力诊断工具,而且除了诊断价值外,mNGS可应用于整个非中性粒细胞减少肺曲霉感染患者病程中曲霉负荷状态的动态监测,从而可进一步检验抗曲霉治疗的疗效及评定抗曲霉治疗疗程。

BALF的mNGS对非中性粒细胞减少肺曲霉感染是一项高效的诊断方法,需被广泛采用。在诊断混合感染和调整抗菌治疗方案及疗效评价方面优于其他检测手段,这种新的方法有成为金标准的潜能。