氰霜唑及其代谢物CCIM在葱中的残留、消解及膳食风险评估

韩帅兵，张耀中，于 淼，薛 雯，李向阳，高中华，周 力

(山东省农药检定所，山东 济南 250100)

葱是一种常见的蔬菜或调味品，在我国各地均有种植，且种植面积及产量持续增长[1]，已经成为一种比较重要的经济作物。葱的生长过程中易发生紫斑病、锈病等病害，影响其产量和质量。氰霜唑是对卵菌门细菌具有高度活性的新型苯基咪唑类杀菌剂，广泛用于防治霜霉病、疫霉病、晚疫病和疫病等病害[2-5]，目前我国在大白菜、番茄、黄瓜、荔枝、马铃薯、葡萄、西瓜等作物上对氰霜唑进行了登记。氰霜唑于田间施用后，在植物体内会迅速分解为4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)结构式(图 1)，其较母体氰霜唑更易被吸收，同时与氰霜唑相比具有更高的毒性[6]。

图1 氰霜唑及其代谢物CCIM结构式

关于氰霜唑在番茄、葡萄、白菜、大蒜等作物上的残留及消解行为的研究国内外已有诸多报道[7-12]。而氰霜唑在葱上的残留、消解及膳食风险评估研究至今还未见报道。本文建立了将样品中氰霜唑及其代谢物CCIM经乙腈提取后，用UPLC-MS/MS检测的方法，并在山东济南、河北定州、河南济源、浙江绍兴、云南曲靖、湖北武汉进行了100 g/L氰霜唑悬浮剂在葱上的1年6地残留及消解动态田间试验，并根据所得试验数据进行了膳食暴露风险评估，为该药在葱上的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

1.1.1 供试材料 供试农药：100 g/L氰霜唑悬浮剂；氰霜唑标准品(纯度98.9%)；CCIM标准品：(纯度99.9%)。

1.1.2 仪器 超高效液相色谱-串联质谱仪(岛津LCMS-8050配有电喷雾离子源(ESI))；

万分之一分析天平(CPA 225D)；百分之一分析天平(CP1502)；自动匀浆机(HESTIA A437)；氮吹仪(N-EVAP112)；移液器；0.22 μm有机滤膜；量筒等。

1.1.3 试剂 乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；NaCl(分析纯)。

1.2 田间试验

1.2.1 试验地点 山东济南、河北定州、河南济源、浙江绍兴、云南曲靖、湖北武汉；试验时间：2018年；小区面积15 m2，重复3次，随机排列，小区间设保护带。另设对照小区。100 g/L氰霜唑悬浮剂剂在葱上防治紫斑病，推荐使用剂量：55～80 g/667m2(82.5～120 g a.i./ha)，喷雾处理，每季最多使用3次，施药间隔7 d。

1.2.2 消解动态 按制剂量120 g/667m2(180 g a.i./ ha，推荐最高用量1.5倍)，于葱生长中期开始施药，小区面积50 m2，施药次数1次，施药后间隔2 h(原始沉积量)、1、3、5、7、14、21、28、35 d采集葱样品。另设清水空白对照。每次随机采集≥2 kg生长正常的葱样本，用不锈钢刀具切碎后充分混匀，缩分后留样，于-20℃冰箱保存，待测。

1.2.3 最终残留 设2个施药剂量：低剂量和高剂量。每个处理设3次重复，每小区15 m2。低剂量按制剂量80 g/667 m2(120 g a.i./ ha)，高剂量按制剂量120 g/667 m2(180 g a.i./ ha)，各设3次和4次施药2个处理，在葱生长中期开始施药，施药间隔为7 d。采样时间距最后一次施药的间隔时间为7、10、14 d。另设清水空白对照。样品采集及处理方法同消解动态。

1.3 检测方法

1.3.1 方法原理简述 葱中的氰霜唑及其代谢物CCIM经乙腈高速匀浆提取，NaCl盐析，上清液用甲醇稀释后，过滤膜，LC-MS/MS检测。

1.3.2 样品前处理 称取葱样品15.00 g于具塞离心管中，加入30.0 mL乙腈，高速匀浆2 min。加入4～5 g NaCl，振荡2 min，3 500 r/m离心5 min。移取1.0 mL上清液于玻璃离心管中，加入1.0 mL甲醇，涡旋，过0.22 μm滤膜待测。

1.3.3 分析测定条件 色谱柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0 mm I.D.×75 mm，1.6 μm)。

流动相：A甲醇，B 0.1%甲酸水溶液

流速及梯度：(表1)

表1 流动相流速及梯度设置

离子源：ESI；检测方式：MRM；电离电压：4.5 kV；碰撞气及压力：Ar，0.23 MPa；雾化气流速：3.0 L/min；检测器电压：1.74 kV；干燥气流速：10.0 mL/min加热气流速：10.0 mL/min；进样量：0.5 μL；监测离子对及碰撞电压(表2)。

氰霜唑、CCIM标准溶液及试验样品谱图(图2～4)。

表2 监测离子对及碰撞电压

图2 氰霜唑、CCIM标准溶液谱图

图3 空白葱样品谱图

图4 葱样品谱图

2 结果与讨论

2.1 线性范围及定量限 氰霜唑和CCIM残留量测定采用外标法定量。分别准确称取适量氰霜唑及CCIM标准品，用甲醇配制成100 mg/L左右的氰霜唑及CCIM标准溶液，再移取适量两种标准溶液用甲醇配制成4.0 mg/L混合标准溶液。为消除液相色谱-质谱联用法检测样品时的基质效应[13]，用空白葱基质溶液逐级稀释成0.002、0.01、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L系列标准溶液，在上述色谱条件下进行测定，以氰霜唑及CCIM的质量浓度与色谱峰面积分别作标准曲线。其中Y为氰霜唑或CCIM峰面积，X为标准溶液质量浓度，结果表明，在0.002～1.0 mg/L范围内，氰霜唑、CCIM峰面积与质量浓度间均成良好的线性关系(图5)。

图5 氰霜唑与CCIM标准曲线

氰霜唑在葱基质中线性方程为：Y= 1.727 12×106X+1 372.1R2=0.998 8

CCIM在葱基质中线性方程为：Y=810 216X+729.1R2=0.995 0

通过最小添加水平得到氰霜唑和CCIM在葱中的定量限(LOQ)均为0.01 mg/kg。

2.2 添加回收率和精密度 在葱空白样品中，分别添加0.01、0.1、2.0 mg/kg 3个质量分数水平的氰霜唑、CCIM标准溶液，每个水平重复5次，用上述分析方法测定回收率。CCIM在葱中的添加回收率为84.6～92.0%，相对标准偏差为1.1%～2.9%(表3)；氰霜唑在葱中的平均添加回收率为91.7%～94.3%，相对标准偏差为2.0%～2.1%(表4)，符合农药残留分析标准要求。

表3 CCIM在葱中添加回收率试验结果

表4 氰霜唑在葱中添加回收率试验结果

2.3 氰霜唑在葱中的消解动态 山东氰霜唑在葱中的原始沉积量为2.83 mg/kg，药后14 d消解达85.2%，药后21 d以后样品中残留量均<0.01 mg/kg；浙江氰霜唑在葱中的原始沉积量为3.46 mg/kg，药后14 d消解达94.4%，药后28 d以后样品中残留量均<0.01 mg/kg，总的来说消解速度较快。氰霜唑的残留量(C，mg/kg)与其施药后的取样时间(t，d)之间呈较明显的负指数关系，可用一级化学反应动力学方程式：Ct=C0e-kt，(其中C0为施药后氰霜唑的原始沉积量，Ct为取样间隔t时间的氰霜唑的浓度，k为消解速率常数，t为取样间隔的天数)来表示。山东为：C= 2.769e-0.18t，R2=0.910，T1/2=3.9 d；浙江为：C= 2.608e-0.18t，R2=0.962，T1/2=3.9 d。具体检测数据(表5)，拟合曲线(图6)。

表5 氰霜唑在葱中消解动态试验结果

图6 氰霜唑在葱上的消解动态曲线

2.4 氰霜唑在葱中的最终残留 在葱上的最终残留试验低剂量按制剂量80 g/667 m2(120 g a.i./ha)和120 g/667 m2(180 g a.i./ ha)于葱生长中期进行第1次施药，施药间隔期7 d，施药3～4次，于末次施药后间隔7、10和14 d采集葱样本分析测试。试验结果如下：

采收间隔期7 d，氰霜唑残留量为0.029～6.15 mg/kg，CCIM残留量为<0.01～0.056 mg/kg；采收间隔期10 d，残留量为氰霜唑残留量为<0.01～2.01 mg/kg，CCIM残留量为<0.01～0.014 mg/kg；采收间隔期14 d，残留量为氰霜唑残留量为<0.01～1.88 mg/kg，CCIM残留量为<0.01～0.014 mg/kg。具体数据(表6、7)。

2.5 氰霜唑在葱上的膳食风险评估 JMPR会议(2015 Evaluation)报告规定氰霜唑膳食摄入评估定义为氰霜唑与其代谢物CCIM之和[14]，则氰霜唑(含CCIM)残留量按照以下公式进行计算：

公式中，X为氰霜唑(含CCIM)残留量，C氰霜唑为氰霜唑残留量，CCCIM为CCIM残留量，当CCIM残留量

表6 氰霜唑在葱中的最终残留

表7 CCIM在葱中的最终残留

表8 氰霜唑(含CCIM)在葱中的最终残留

依据2004年卫生部发布的《中国不同人群消费膳食分组食谱》，综合试验所得的残留试验中值和已制定的最大残留限量(MRLs)，采用以下公式进行膳食风险评估。

NEDI(mg/kg，bw)=

其中，NEDI为每日摄入量；FI为食物摄入量；STMR为试验所得残留中值或已制定的最大残留限量；bw为中国居民平均体重，为63 kg；RQ为风险商，ADI为每日允许摄入量，我国规定氰霜唑的ADI值为0.2 mg/kg bw[15]。RQ值越高表示风险越高，RQ>1则表示对人类健康的风险不能接受。

基于风险最大化原则，本研究将目前氰霜唑在我国已有的登记作物均纳入了膳食风险评估范围，包括大白菜、番茄、马铃薯、黄瓜、葡萄等作物，这些作物中国均规定了最大残留限量[15]。本研究根据葱10 d采收间隔的最终残留数据来评估氰霜唑的长期膳食风险，所用残留中值、参考限量值及评估结果(表9)。结果表明，氰霜唑在所有登记作物中的膳食暴露风险值RQ为0.12，远低于1。因此，氰霜唑在葱中的残留量对我国一般人健康风险可以接受。

表9 葱中氰霜唑膳食风险评估结果

3 结论

研究建立了UPLC-MS/MS测定葱中氰霜唑及其代谢物CCIM残留量的分析方法。结果表明：氰霜唑和CCIM在葱中的定量限(LOQ)均为0.01 mg/kg。氰霜唑在葱中添加质量分数为0.01～2.0 mg/kg时，平均回收率为91.7%～94.3%，相对标准偏差为2.0%～2.1%；CCIM在在葱中添加质量分数为0.01～2.0 mg/kg时，平均回收率为84.6%～92.0%，相对标准偏差为1.1%～2.9%。方法的重现性好，回收率、精密度及检出限均可满足该农药的残留分析要求。

氰霜唑在葱中的残留消解符合一级动力学方程，在山东、浙江的半衰期均为3.9 d。

我国制定氰霜唑在葱上的最大残留限量为5 mg/kg，氰霜唑的ADI值为0.2 mg/kg bw。最后1次施药后10 d，六地葱中氰霜唑的残留量为<0.01～2.01 mg/kg，均未超过我国规定的氰霜唑在葱中的MRL值；根据膳食风险评估结果，氰霜唑日均摄入风险商值为0.12，<1，不会对一般人群健康产生不可接受的风险。

试验结果：100 g/L氰霜唑悬浮剂，防治葱紫斑病，最高制剂用药量80 g/667 m2(有效成分120 g a.i./ha)，最多施药3次，施药间隔7 d，安全间隔期为10 d。