《伤寒论》方治疗糖尿病肾病的数据挖掘及核心药物的网络药理学研究*

吴伟,樊启辉,黄艳丽

江西中医药大学附属医院,江西 南昌 330000

糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一[1-2],其发病机制尚不完全清楚[3],终末期会导致肾功能衰竭。张仲景《伤寒论》以六经钤百病[4],有关《伤寒论》方治疗糖尿病肾病的临床和实验研究较多,但尚无此类研究的数据挖掘报道。笔者通过数据挖掘,总结糖尿病肾病的六经辨证特点,药物运用规律,发现核心药物;结合核心药物的网络药理学分析,推测疾病的发病规律,为糖尿病肾病的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源选取中国学术期刊全文数据库(中国知网)、万方数据库、中文科技期刊数据库(维普),中国生物医学文献数据库(CBM)、英文数据库Pubmed中关于《伤寒论》方治疗糖尿病肾病的文献。

1.2 文献纳入及排除标准纳入《伤寒论》单方、合方治疗糖尿病肾病的临床研究、动物实验研究文献;排除一般性综述、循证研究、细胞实验研究、其他联合用药研究及雷同文献。

1.3 资料检索与收集两名研究者以《伤寒论》112首方剂“方名”如“桂枝汤”或“六经”“经方”“伤寒论”和“糖尿病肾病”为检索词检索中文数据库,以英文方名如“Guizhi Decoction”和“diabetic nephropathy”为检索词检索英文数据库,检索时间均为建库至2021年12月31日。剔除不符合要求文献,制作Excel表,横目录标题为临床研究、动物实验研究,纵目录标题为112首方剂方名和合方名。

1.4 数据分析方法数据采用Excel表、SPSS 24.0、SPSS Modeler 18.0、云图汇等工具进行分析。累积条图呈现各方剂研究频数及类型分布;桑基图展示所纳入方剂在六经病的分布比例;热力图发现核心应用的药物;太阳辐射图分析药物的四气五味、归经特征;关联规则分析药物间的关联度;聚类分析观察药物间的聚集模式;环形图呈现方剂对应原文证候分布;关系图展示药物与证候间的联系;堆叠玉珏图发现纳入方剂的疗效;云雨图发现药物的剂量规律。网络药理学用TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、Genecards等数据库筛选活性成分及疾病靶点,运用Cytoscape 3.9.0软件绘制互作图发现疾病-成分-靶点关系,Metascape数据库进行基因本体(gene ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析探讨其作用机制。

2 结果

2.1 文献检索结果及特征初步检索中文文献387篇,英文文献2篇,逐一筛选,最终纳入17篇文献,均为中文,其中动物实验研究5篇[5-9],临床研究12篇[10-21]。所用方剂有大黄黄连泻心汤、五苓散、真武汤、抵当汤、葛根芩连汤、五苓散合四逆汤、小柴胡汤、小陷胸汤、芍药甘草汤、苓桂术甘汤、桂枝汤、桃核承气汤等。

2.2 六经病分布各方剂所治疗病证以太阳病最多,共出现12次,阳明病出现5次,厥阴病出现2次,少阳病、太阴病、少阴病、太阳合阳明病、太阳合少阴病、太阳合厥阴病、阳明合少阴病、阳明合厥阴病各1次,具体见图1。

图1 各方剂治疗六经病的桑基图

2.3 药物频次分析所有纳入的方剂共23味中药,应用频率在前20%的药物分别是甘草、桂枝、茯苓、白术,见图2。

图2 各方剂中药物频次热力图

2.4 药物四气五味、归经分析药物四气以寒性居多,五味以苦味、甘味、辛味居多,归经依次为脾经、胃经、肺经、心经、肝经,见图3。

图3 药物四气五味、归经太阳辐射图

2.5 药物关联设定最小支持度10%,最小置信度80%时,获得两药和三药的关联规则。置信度100%时,最大支持度的药对是白术和茯苓;置信度80%时,最大支持度的药对是桂枝和甘草;置信度100%时,最大支持度的三药是白术、茯苓和桂枝。见表1、表2。

表1 两种药物关联规则

表2 三种药物关联规则

2.6 药物聚类聚类图以标尺值10为界点,将药物分成七类,具体见图4。第一类:柴胡、人参、大枣、生姜、半夏、瓜蒌,功效:和解少阳,兼扶土气;第二类:葛根、黄连、黄芩,功效:解太阳表邪,清阳明里热;第三类:水蛭、虻虫、桃仁、芒硝、大黄,功效:攻瘀逐热,清降阳明;第四类:白芍,功效:养血敛阴;第五类:附子、干姜、茯苓、白术、泽泻、猪苓,功效:温肾利水,少阴太阳同治;第六类:桂枝,功效:散寒解肌,通阳化气;第七类:甘草,功效:益气健脾,调和诸药,补中央土气斡四方。

图4 药物聚类图

2.7 证候与药物关联涉及的原文证候共36种,以发热最多,见图5。

图5 证候分布图

2.8 疗效分析纳入文献中共有疗效指标40种,其中真武汤疗效指标最多;研究频数前20%的指标有血肌酐、24 h尿蛋白、尿素氮、内生肌酐清除率、有效率、肾脏病理、中医证候、空腹血糖,见图6。治疗组能降低血糖、减少24 h尿蛋白、改善肾组织损伤、提高肾功能、改善中医证候、提高有效率等。

图6 各方剂疗效的堆叠玉珏图

2.9 药物剂量分析附子、半夏、生姜、大枣用量较固定:附子一枚,半夏半升,生姜3两,大枣12枚。药物剂量离散度分析,白芍剂量相对最集中,茯苓最离散,中位数以白芍剂量最大,见图7。

图7 各药物剂量的云雨图

3 网络药理学研究

3.1 活性成分筛选结果利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索高频核心药物甘草、桂枝、茯苓、白术有效成分,并限定口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18。将所得有效成分通过其化学名在有机小分子生物活性数据库PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)进行搜索,得到各成分简化分子线性输入规范(SMILES)。

3.2 化学成分靶点预测结果将搜索到的SMILES式通过Swiss Target Prediction 服务器虚拟筛选,共得到核心药物成分靶点基因754个。筛选活性成分-靶点关系度≥20%,获得活性成分桂枝2个,茯苓8个,白术1个,甘草30个,靶点基因146个,成分-靶点关系434个。

3.3 疾病靶点获取在Genecards(https://www.genecards.org/)数据库中检索“diabetic nephropathy”,得出糖尿病肾病相关靶点,以相关性分数≥10作为筛选条件,筛选结果作为疾病的候选靶点基因,共406个。

3.4 成分-靶点网络构建将得到的成分-靶点关系以Excel格式导入Cytoscape 3.9.0软件中,设置网络节点、边等基本属性,得到成分-靶点网络图,见图8。41个节点代表活性成分,146节点代表与活性成分相关的靶点基因。以节点度degree值反映靶点大小,节点度>10的成分有GC3(Mairin)、GC30(Licochalcone B)、GC22(kanzonols W)、GC6(Medicarpin)、GC4(Glycyrol)、FL4(Cerevisterol)、FL7(Ergosterol peroxide)、GZ1(taxifolin)、GZ2(beta-sitosterol),节点度>10的靶点有PTPN1、CYP19A1。

图8 成分-靶点网络图

3.5 蛋白相互作用(PPI)网络构建利用韦恩图得到成分和疾病共有的潜在靶点29个,导入STRING获得蛋白相互作用,信息导入Cytoscape 3.9.0软件绘制蛋白相互作用(PPI)网络,进行网络拓扑结构分析,以combined score值反映边的粗细,以节点degree值反映靶点大小及颜色,从而构建蛋白互作网络,见图9。

图9 蛋白相互作用网络

3.6 疾病-成分-靶点网络利用 Cytoscap 3.9.0中的merge功能将成分-靶点网络和蛋白相互作用网络合并,得到的疾病-成分-靶点网络为两个网络的重叠部分,见图10。

图10 疾病-成分-靶点网络

3.7 GO和KEGG分析利用Metascape(https://www.metascape.org/)数据库对共同靶点进行GO分析,见图11,生物过程主要涉及肽的反应、平滑肌细胞增殖的调节、细胞酮代谢、细胞对化学应激的反应、炎症反应的调节等过程;细胞组分主要涉及膜侧面、溶解液泡、转移酶复合物、细胞外基质、膜筏等组分;分子功能主要涉及激素结合、核受体活性、脂肪酸结合、磷酸酶结合、丝氨酸内肽酶结合等功能。进行KEGG通路富集分析,见图12,通路涉及肿瘤通路、腺苷酸激活蛋白激酶信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。

图11 GO分析图

图12 KEGG通路富集分析图

4 讨论

本研究纳入的文献类型有动物实验研究和临床研究,5项动物实验研究中结局指标均有肾脏病理结果,病理结果示肾小球体积增大、肾小球系膜基质增宽、基底膜广泛增厚等,与人类早期糖尿病肾病病理改变一致[22]。

糖尿病肾病的六经辨证中,以太阳病最常见,其次是阳明病。太阳阳气最盛,为六经之藩篱,统摄营卫[23-24]。王肯堂《证治准绳》曰:“人之一身,本乎营卫”,营卫正常则病不生,营卫气乱则病起,故糖尿病肾病也常从太阳病论治。药物频次分析发现核心药物是甘草、桂枝、茯苓、白术,桂枝辛温补阳从皮毛散寒,同时补火制水;茯苓入肺、脾、肾经,防桂枝辛温太过;白术入脾胃经,补后天之本;甘草健脾胃,调和诸药[25-27]。

药物关联分析中白术、茯苓关联度最大,二药合用,一补一渗,益气健脾渗湿,以复中焦运化之职;白术、茯苓配伍桂枝,桂枝温阳化气以行水,温脾、利水之力增强。桂枝配甘草,辛甘化阳,补益之力倍增,祛邪之力更强。聚类分析第一类为小柴胡汤方中药物,用瓜蒌代替黄芩润肠泄热,清热同时加强通腑之力;第二类为葛根芩连汤方中药物,辛凉与苦寒同用,解表又清里;第三类为抵当汤方中药物,合用芒硝以增强泄热之功;第四类药物为白芍,白芍乃养阴柔肝第一药,柔肝可熄风;第五类为四逆汤合五苓散方中药物,水为阴邪,赖阳气化之,阳气通达,则水湿得化,一补一泻,补而不留邪,泻而不伤正;阳虚有寒用桂枝,桂枝温阳化气,散寒解表,兼补散于一体。中气不足,脾失健运用甘草,甘草补中,调和诸药。

核心药物的网络药理学发现,甘草治疗糖尿病肾病的活性成分有30个,关键成分有白桦脂酸、甘草查耳酮B、康唑醇W、美迪紫檀素、甘草醇5个;茯苓的活性成分有8个,关键成分有脑甾醇、过氧化麦角甾醇2个;桂枝的活性成分有2个,关键成分分别是紫杉叶素、β-谷甾醇;其中以甘草的白桦脂酸、甘草查耳酮B、康唑醇W作用最显著。有研究显示,白桦脂酸有降糖、减少氧化应激、抗炎、维持线粒体稳定、抗凋亡的作用[28-31]。糖尿病肾病发病机制复杂,与高血糖、氧化应激、炎症反应等多因素相关,白桦脂酸可以从多个靶点保护肾脏。核心药物治疗糖尿病肾病的潜在靶点有29个,其中以非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1、细胞色素P450超家族芳香化酶19A1为关键靶点。有研究发现,非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1可以使PI3K/Akt上游分子IRS1发生去磷酸化,从而抑制胰岛素信号通路的传导,参与胰岛素抵抗[32-33]。细胞色素P450超家族芳香化酶19A1基因多态性与糖代谢相关,推测非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1与细胞色素P450超家族芳香化酶19A1可以从糖代谢途径保护肾脏。GO分析生物过程肽的反应最强烈,细胞组分膜侧面最突出,分子功能激素结合反应最常见。KEGG分析发现,除肿瘤通路外,腺苷酸激活蛋白激酶信号通路最活跃。