基于网络药理学与分子对接探讨痰热清注射液治疗COPD的作用机制

郝俊峰 陈微 陈建建

摘要：目的 基于網络药理学方法探讨痰热清注射液治疗慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）的潜在作用机制。方法 采用文献检索收集痰热清注射液的有效化学成分，利用Pubchem及ChEMBL数据库的收集有效成分的靶点；利用OMIM，DrugBank，Genecards，Disgenet数据库检索慢性阻塞性肺疾病（以下简称慢阻肺）的相关靶点；取痰热清注射液靶点及慢阻肺靶点的交集，得到核心靶点；将核心靶点导入String平台进行蛋白质相互作用分析，构建PPI网络图并挖掘其中潜在的蛋白质功能模块；利用Metascape对核心靶点进行GO和KEGG富集分析；使用Cytoscape软件构建慢阻肺与信号通路的网络图。最后运用AutoDockVina对Degree值前十的基因及有效成分进行分子对接。结果 得到有效化学成分107个，药物靶点1722个，COPD靶点6525个，最终获得核心靶点1327个。痰热清注射液治疗慢阻肺主要成分为香豆素、咖啡酸、6-氨基己酸等，关键靶点为TP53、HSP90AA1、SRC等。结论 本研究初步揭示了痰热清注射液多成分，多靶点，多通路治疗慢阻肺得到潜在机制，为痰热清注射液的基础及临床研究提供了依据。

关键词：痰热清注射液；慢性阻塞性肺疾病；网络药理学；分子对接

中图分类号：R563.3 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2023）04-0048-08

Study on the Mechanism of Tanreqing Injection in theTreatment of COPDBased on Network Pharmacology and Molecular Docking

HAO Jun-feng1， CHEN Wei¹， CHEN Jian-jian²

（1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330000， China;2. Jiangxi Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanchang 330000， China）

【Abstract】Objective： To study the potential mechanism of Tanreqing Injection in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） based on network pharmacology. Methods： The active chemical components of Tanreqing Injection were collected through literature retrieval， and the targets of active components were collected by using Pubchem and ChEMBL databases. The targets related to COPD were searched by OMIM， DrugBank， Genecards and Disgenet databases. The intersection of Tanreqing Injection target and COPD target was collected to obtain the core targets. The core targets were imported into the String platform for protein interaction analysis， PPI network diagram was constructed and potential protein functional modules were mined. The GO and KEGG enrichment of the core targets were analyzed by Metascape. The network diagram of COPD and signaling pathways was constructed by using Cytoscape software. Finally， AutoDockVina was used for molecular docking of genes and active components with the top 10 degrees. Results： 107 effective chemical components， 1722 drug targets， 6525 COPD targets and 1327 core targets were obtained. The main components of Tanreqing Injection in the treatment of COPD were coumarin， caffeic acid， 6-aminocaproic acid， etc. and the key targets were TP53， HSP90AA1， SRC， etc. Conclusion： This study preliminarily reveals the potential mechanism of Tanreqing Injection in the treatment of COPD by multi-component， multi-target and multi-pathway， which provided a basis for the basic and clinical research of Tanreqing Injection.

【Key words】Tanreqing Injection; Chronic Obstructive Pulmonary Disease; Network Pharmacology; Molecular Docking

COPD是一种临床表现为持续性气流受限，病理表现为气道和（或）肺泡异常的最常见的慢性气道疾病。COPD是全球发病率、死亡率和医疗保健负担的主要原因，新型冠状病毒流行更是影响了COPD患者，他们不仅比健康人更容易出现严重疾病表现，而且还受到医疗保健服务中断和社会孤立的负面影响^［1］。世界卫生组织指出，到2030年，慢性阻塞性肺疾病（COPD）可能成为第三大死亡原因^［2］。因此，慢阻肺是一个大众人类生命健康，影响社会发展的疾病。传统中医药因其治疗手段多样，药物靶点多样，耐药性低等在治疗慢阻肺中有光明前景。

痰热清注射液由王永炎院士组方、曹春林教授工艺开发，历经数年艰苦研制于2003年成功上市。作为一款清热解毒的中药复方注射液，痰热清注射液是由金银花、黄芩、连翘、山羊角、熊胆粉等清热解毒药组方而成，具有清热解毒，化痰的功效，并已被广泛应用于COPD的临床治疗。对5种清热注射液治疗AECOPD的系统性评价中也发现痰热清注射液是治疗AECOPD患者最有效的疗法^［3］。本研究运用网络药理学及生物学信息技术方法研究痰热清有效成分的潜在作用靶点，以探讨其治疗慢阻肺的作用机制，以期为今后的基础及临床研究提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 痰热清注射液中活性成分的筛选和靶点预测 我们通过中国知网（CNKI）、万方数据库、维普数据库，进行痰热清注射液化学成分相关文献检索。将各文献中的化学成分进行合并整理，得出目前已知的痰热清注射液的化学成分。经Python软件的Rdkit包，计算各化学成分的QED值^［4］，我们选取QED值>0.18的化学成分作为本次研究的活性成分。将活性成分导入Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ChEMBL数据库（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）查阅活性成分靶点，经合并整理得出痰热清注射液的药物靶点。

1.2 构建痰热清注射液活性成分-靶点网络 使用Cytoscape3.9.1软件对已获取的靶点预测信息进行网络构建，并使用NetworkAnalyzer分析工具对结果进行分析得出相关评价指标：连接度（degree），以研究该网络的互相作用关系并对结果进行可视化。

1.3 慢阻肺相关靶点检索 以“chronicobstructivepulmonarydisease”，“COPD”为关键词，在Genecards（http：//www.genecards.org/），OMIM（https：//omim.org/），Disgenet（https：//www.disgenet.org/）等疾病基因数据库中进行筛选，在剔除重复值后最终得到与慢阻肺相关靶点基因。

1.4 痰热清注射液成分-慢阻肺靶点PPI网络构建 为明确补元汤与慢阻肺之间相互作用的关系，利用R语言对二者相互交叉的靶点进行可视化。将获取的交叉靶点提交至String（https：//www.string-db.org/）平台上构建蛋白质互作（PPI）网络，将物种选择为“Humosapiens”，最小互作用阈值调整至“highestconfidence”，其余选项均为默认，得到PPI网络图。将所得PPI网络图导入进Cytoscape3.9.1运用MCODE插件对PPI网络进行进一步分析，得到潜质蛋白质功能模块，并对其进行生物学描述。

1.5 痰热清注射液-慢阻肺靶点功能与通路富集分析 运用Matescape平台（http：//metascape.org/gp/index.html）对痰热清注射液与慢阻肺交叉靶点进行GOBP，GOMF，GOCC，KEGG富集分析，并对结果进行可视化。

1.6 分子对接 选取Degree值前10的活性成分及靶点，运用AutodockVina进行分子对接模拟。靶点基因蛋白晶体选取RCSB数据库（https：//www.pdbus.org/）中已实验验证且评分第一位的蛋白晶体结构，活性成分的3D结构取自PubChem数据库。应用PyMOL对结合能末4位的分子对接模型进行可视化。

2 结果

2.1 痰热清注射液活性成分靶点的收集 根据王亮等人的总结^［5］得出痰热清注射液包含107种化学成分，QED值>0.18的有81种，QED值排名前10位（见表1）。PubChem及ChEMBL中有靶点记录的活性成分有57个，活性成分靶点共1721个。

2.2 痰热清注射液活性成分-靶点网络 将上步所得结果导入Cytoscape3.9.1软件构建痰热清注射液活性成分-靶点网络图（见图1）

2.3 慢阻肺相关靶点的收集 查询Genecards，OMIM，Disgenet疾病基因数据库，剔除重复值最终纳入6524个与慢阻肺相关的靶点基因。

2.4 痰热清注射液活性成分-慢阻肺靶点PPI网络构建 将筛选过后的痰热清注射液活性成分与慢阻肺相关靶点基因取交集，到补元汤活性成分-慢阻肺共有靶点1721个。

将所得1721个靶点提交至String平台，经Cytoscape3.9.1軟件得出PPI网络图（图2）。在复杂的PPI网络图中存在部分密度高的区域称为module，其功能在整个网络系统中发挥重要作用，故有必要进一步导入Cytoscape3.9.1软件对其进行深入分析。经过内置MCODE插件的算法分析，得到module。选取其中2个最佳评分的生物学进程对其进行可视化（图2）。

2.5 痰热清注射液成分-慢阻肺靶点功能与通路富集分析 应用Matescape数据平台对痰热清注射液活性成分-慢阻肺共有靶点进行信号通路分析，包括GO的BP图（biologicalprocess）、MF（molecularfunction）、CC（cellularcomponent）以及KEGG通路，并选取LogP绝对值排名后10名结果，借助R语言对结果进行可视化（图3）。

2.6 分子对接结果 应用分子对接工具AutodockVina软件对Degree值排名前10的活性成分及靶点基因蛋白进行分子对接。结合能越低表示分子与蛋白结合活性越高，分子对接结果显示结合能均≤-3.8 kJ·mol^-1，表示核心成分具有较好的活性。此外我们还发现熊去氧胆酸（31401）、胆酸（221493）、黄芩素（5281605）、鹅去氧胆酸（10133）与各核心靶点结合能均≤-6.4 kJ·mol^-1，提示他们与靶点蛋白结合时具有更高的活性。分子对接结合能结果见表2。并应用PyMOL对结合能较低的前4位进行可视化（图4）。

3 讨论

本研究从痰热清注射液的107种有效性成分中，根据QED值、PubChem及ChEMBL数据库筛选出57种有靶点记录的活性成分，活性成分靶点共1721个。通过痰热清注射液活性成分-靶点网络图，选取Degree值前10位为痰热清注射液的核心成分，依次为香豆素、咖啡酸、6-氨基己酸、苯甲酸、熊去氧胆酸、胆酸、黄芩素、邻苯二甲酸二丁酯、肌醇、鹅去氧胆酸。香豆素具有广泛的抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用^［6］；咖啡酸已被广泛用作对抗微生物发病机制和由细菌、真菌和病毒等微生物引起的慢性感染的替代方案^［7］；6-氨基己酸是一种具有疏水性、柔性结构的ω-氨基酸，临床上常作为抗纤维蛋白溶解剂^［8］。近来研究发现过量的纤溶酶生成经常促成急性和慢性炎症过程^［9］；苯甲酸具有抗微生物作用^［10］；熊去氧胆酸是肠道细菌转化脱氧胆酸后产生的次级胆汁酸，是肠道屏障完整性的关键调节剂，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和细胞保护活性^［11］；胆汁酸、鹅去氧胆酸不仅是消化表面活性剂，也是重要的细胞信号分子，可刺激多种信号通路来调节一些重要的生物过程，调节炎症反应、屏障功能和调节肠道菌群方面发挥着关键作用^［12-13］；黄芩素是一种生物活性类黄酮，具有抗炎和抗癌活性^［14］，抗氧化和抗炎活性主要是由于它们具有清除活性氧（ROS）和通过减弱NF-κB的活性^［15］和抑制包括单核细胞趋化蛋白在内的几种炎性细胞因子和趋化因子的表达来改善抗氧化状态的能力^［16］；肌醇不仅是膜结合磷脂酰肌醇的重要成分，而且以其游离形式及其异构体或其磷酸盐衍生物参与多种细胞过程，包括离子通道通透性、代谢稳态、mRNA输出和翻译，细胞骨架重塑，应激反应。邻苯二甲酸二丁酯具有生殖毒性，提示我们应监测痰热清注射液远期可能存在的不良反应。

将药物靶点与COPD的靶点取交集，得出核心靶点。根据PPI网络图，我们根据Degree值高低筛选出10个核心靶点，依次是TP53、HSP90AA1、SRC、MAPK3、STAT3、MAPK1、ESR1、HDAC1、AKT1、CTNNB1。众所周知，COPD是慢性气道炎症性疾病，炎症和氧化应激是伴随、促进甚至引发多种癌症的的病理过程。具体而言JAK/STAT3^［17］信号传导、CTNNB1突变引起的癌症的经典通路WNT/β-连环蛋白^［18］，临床上也发现COPD与肺癌高度相关。肺癌特别是小细胞肺癌（SCLC）几乎总是包括肿瘤抑制基因TP53^［19］的功能失活，STAT3^［20］在肿瘤生态系统中的癌症和非癌细胞中都被广泛过度激活，ESR1所调控雌激素受体（Estrogenreceptor）^［21］也被视为肺癌的发生机制。SRC蛋白激酶抑制劑^［22］正积极开展肺癌在内的多种实体瘤的临床试验。HDAC抑制剂（HDACi）具有多效性细胞作用并诱导促凋亡基因/蛋白质的表达，治疗在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中显示出抗增殖活性。在免疫应答中，Akt信号通路成分通过控制炎性细胞因子、miRNA和包括吞噬作用、自噬和细胞代谢的功能，在巨噬细胞生物学和炎症性疾病调节中具有独特的亚型特异性作用。HSP90AA1调控热休克蛋白^［23］（Heatshockprotein）的产生，热休克蛋白能抑制肺部炎症。MAPK1^［24］及MAPK3^［25］调节TNF-α产生、NADPH氧化酶激活、中性粒细胞迁移和DNA损伤诱导的细胞周期停滞中的分子机制的知识，这些机制涉及COPD在内的肺部炎症。

GO富集分析发现，痰热清注射液能影响细胞的突触及树突传导，蛋白结构域特异结合，转录因子结合，以及细胞对氮化合物的反应，激素反应来起到治疗COPD的作用。KEGG富集通路包括癌症通路（Pathwaysincancer）、神经活性配体-受体相互作用（neuroactiveligand-receptorinteraction）。

本研究通過网络药理学及分子对接的方法初步发现痰热清注射液治疗COPD的活性成分、靶点及通路。痰热清注射液通过抑菌、调节免疫来降低炎症反应，并可能具有预防COPD转化为肺癌的可能。本研究还需实验进一步验证，以期为基础实验提供参考。

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（收稿日期：2022-11-21）