“陈皮-半夏”治疗稳定型心绞痛的作用机制研究*

谢博欢，李雁，常艳宾，林腾龙，李琳琳

黑龙江省中医药科学院 黑龙江哈尔滨 150036

稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）又可称劳力性心绞痛，是慢性冠状动脉综合征 （chronic coronary syndrome，CCS）中的较为常见的疾病。随着SAP 患病率以及病死率的逐年升高，近年来SAP被WTO 认为是心血管疾病中最常见的威胁人类健康的主要死因[1]。临床常用药为：β 受体拮抗剂、ACEI/ARB 类、硝酸酯制剂、抗血小板药、钙通道阻滞剂、降脂药等药物，虽然治疗效果不错，但是服用这些药物有可能会出现某些不良反应导致患者停药，又或长期服用会导致机体产生耐药性，此外还有患者依从性差等其他原因，进而会影响整体的治疗效果。而在祖国医学领域中，随着对SAP 认识的逐渐加深，中医药不仅具备疗效好、安全性高、不良反应发生率低这些优点，而且还同时具有延缓病情发展、降低疾病复发率、改善预后等其他方面的独特优势，拥有非常广阔的研究前景。

陈皮、半夏作为临床常用药，两者常相须为用，而且通常作为治疗心血管疾病的核心药对被广泛使用，用来治疗较为常见的痰浊阻滞型SAP[2]。网络药理学构建药物的“活性成分-靶标-通路-疾病”网络，是建立在生物信息学、系统生物学、药理学等多个学科的技术和知识的基础之上，可以帮助我们更加得清楚药认识药物疾病之间的关系，了解药物作用于疾病的机制，是一种可以全面、系统得进行科学研究的方法，为中医药的进一步研究提供了新方法、新角度，为广大学者所喜爱。本研究借助网络药理学，研究药对“陈皮-半夏”治疗SAP 的作用机制，从而为其治疗SAP 的药理学研究及临床应用提供进一步参考。

资料与方法

1 “陈皮-半夏”中活性成分的筛选和靶点预测

在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）网络平台分别以陈皮、半夏作为关键词检索、获取其活性成分，并筛选活性成分，筛选的条件设置为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，筛选得到活性成分后选择“R elated Targeted”，进一步检索筛选出来的活性成分，得到药物活性成分的相关靶点，再利用Uniport（https：//www.uniprot.org/）统一整合成Gene ID。

2 构建“陈皮-半夏”“活性成分-靶点”网络图

将陈皮、半夏得活性成分以及靶点导入CytoScape 3.8.0 构建出网络图，在构建出的网络中药物活性成分、活性成分的靶点基因用“节点”（node）表示，二者之间的关系用“边”（edge）表示；使用CytoScape 内置的Network Analyzer 工具分析这个网络图特征，包括网络连接度（degree）、介度（betweenness）和紧密度（closeness）等数据，以此研究药物的活性成分与靶点基因及两者之间的关系。

3 稳定型心绞痛相关靶点检索

将“stable angina pectoris”作为关键词，在Gene cards（https：//www.genecards.org）、Drug bank（https：//go.drugbank.com/）、OMIM（http：//www.omim.org）、OMIM-Gene Map（http：//wwwomim.org/search/advanced/geneMap）等疾病基因数据库检索、筛选，整理得出的结果，之后在Uniprot 数据库中将结果进行统一规范，并借助VENNY2.1 获得药物与疾病的交集靶点基因（靶点蛋白）。

4 蛋白质互作网络及模块构建

使用String（https：//cn.string-db.org/）构建蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络。将“陈皮-半夏”与SAP 的交集靶点分别导入String 内，生成PPI 网络，导出结果，利用CytoScape3.8.0，绘制高级PPI 网络图。运用CytoScape 中的MCODE 插件，通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，构建不同功能模块。

5 通路富集分析

将交集靶点导入Metascape 网络平台（https：//metascape.org） 进 行GO-BP（biological process）、GO-CC（cellular component）、GO-MF（molecular function）KEGG 分析，保存分析结果并通过微生信网站进行可视化。

6 “药物成分-疾病靶点-通路”网络构建及分析

借助CytoScape3.8.0 来构建“药物成分-疾病靶点-通路”网络图，图中“节点”代表活性成分、通路，“边”代表二者之间的作用关系；使用CytoScape 中的Network Analyzer 分析网络特征，包括连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closeness）等，以研究活性成分、通路及靶点基因及其相互之间的关系。

结 果

1 “陈皮-半夏”活性成分、靶点的获取

在TCMSP 数据库初步获取成分陈皮63 个，半夏116 个，通过OB 和DL 参数筛选后，获得活性成分陈皮5 个，半夏13 个，共18 个见表1。选择Related Targets 预测陈皮、半夏筛选出的活性成分的靶点，并利用Uniport 转换成gene ID，获得陈皮活性成分靶点基因66 个，半夏活性成分的靶点基因136，共获得202 个靶点基因。

表1 “陈皮-半夏”活性成分

2 “陈皮-半夏”活性成分-靶点网络构建和分析

将陈皮、半夏的活性成分以及其相应的靶点基因导入CytoScape3.8.0 绘制其关系网络图并分析，共获得106 个节点与219 条关系，结果见图1（节点表示活性成分、靶点基因，连线表示作用关系，节点大小、节点颜色深浅和节点透明度均按degree 值从大到小依次排列，即degree 值越大，节点越大、颜色越深，透明度越高）。

图1 “陈皮-半夏”活性成分-靶点网络

3 SAP 相关靶点检索检索

利用Gene cards、Drug bank 、OMIM、OMIM-Gene Map 等疾病数据库搜索“stable angina pectoris”，得到的靶点个数分别为854、119、101、8，筛选并去除重复值后得到靶点1016 个。利用VENNY2.1 绘制韦恩图可得出药物靶点与疾病靶点交集为48 个，见图2（list1为疾病靶点基因，list2 为药物靶点基因）。

图2 韦恩图

4 “陈皮-半夏”治疗SAP 的PPI 网络构建

4.1 “陈皮-半夏”治疗SAP 的PPI 网络图绘制 运用String 构建“陈皮-半夏”与SAP 共同靶点的PPI网络，将交集靶点基因提交至String 网络平台，得到PPI 网络，剔除掉游离基因后如图3A，保存结果将其导入CytoScape3.8.0，绘制高级PPI 网络图，见图3B。

图3 A PPI 网络

图3 B CytoScape 美化后的PPI

PPI 网络图之所以是无向图，是因为网络中的蛋白质是相互作用的。community 或module 是PPI 中隐藏的子网，是网络中密度较高的区域，是具有生物学意义的合集，可表示蛋白质复合体（protein complex）或者功能模块（functional module）[3]。故为更精确地分析“陈皮-半夏”治疗SAP 的作用机制，在构建出PPI 网络后运用CytoScape3.8.0 中的MCODE 工具，通过其特有算法对活性成分与靶点得相互作用关系进行分析，构建出module1、module2、module3 三个功能模块，见图4A、4B、4C。根据P 值，分别保留Module中3 个最佳评分的生物学进程对其进行功能描述，见表2。

图4 A Module1

图4 B Module2

图4 C Module3

表2 Module1、2、3 最佳生物进程

5 “陈皮-半夏”治疗SAP 通路富集分析可视化

将48 个交集基因导入Metascape 网络平台进行富集分析，分别进行KEGG 以及GO 的BP、CC、MF 富集分析，保存结果，并运用微生信网站将结果中Log10（P）值排名为前20 的绘制气泡图进行可视化，KEGG的可视化结果见图5，GO-BP、CC、MF 的可视化结果见图6（气泡面积大小代表通路中的基因数多少，气泡的颜色由绿到红代表-Log10（P）值从小到大，横轴代表P 值，竖轴代表通路名称）

图5 KEGG 富集分析

图6 GO 富集分析-BC、CC、MF

6 “药物成分-SAP 靶点-通路”网络图构建及关键成分及靶点基因筛选

排除与本病无关的通路后，使用CytoScape 软件制作“药物成分-疾病靶点-通路”网络图，见图7（药物成分用菱形表示，通路用倒三角表示，疾病靶点用圆形表示，作用关系用连线表示，degree 值大小用节点面积大小代表）。并通过CytoScape 内置的Network Analyzer 分析其网络拓扑学参数，分析表明，β-谷甾 醇（Degree）为32，介 度（Betweenness Centrality）为0.2557，紧密度（Closeness Centrality）为0.4474，预测β-谷甾醇为“陈皮-半夏”药对治疗SAP 的关键成分，其次为Cavidine（连接度为27，介度为0.1861，紧密度为0.4182）、川陈皮素（连接度为25，介度为0.2090，紧密度为0.4212），见表3。PTGS2 在网络中的连接度为14，介度为0.1441，紧密度为0.4978，预测PTGS2 为“陈皮-半夏”药对治疗SAP 的最主要靶点。HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 亦为相对重要的靶点。

图7 “药物成分-疾病靶点-通路”网络图

表3 “陈皮-半夏”治疗SAP 的关键靶点网络节点特征参数

讨 论

稳定型心绞痛（SAP）在祖国医学中学中归为“胸痹”“心痛”病的范畴，引起疾病发生的内外因素包括：情志失调、饮食不节、劳倦内伤、寒邪内侵、体虚等，其病位在心、肝、肾、脾等脏腑，主要在心，基本病机为“阳微阴弦”，为本虚标实之证，本虚为气、血、阴、阳亏虚以致心脉失养；标实为寒凝、血瘀、气滞、痰浊导致胸阳不展、心脉不通[4]。由于现在人们饮食上膏粱厚味，导致痰浊内生，阻滞气机，所以临床中痰浊阻滞型SAP 较为常见，“陈皮-半夏”在临床中是常用的理气祛痰药对，陈皮味苦、辛，性温，燥湿化痰、理气开胸，半夏味辛，性温，温化寒痰，尤善治脏腑之痰，两者相须为用，可理气化痰，通痹止痛[5]，有效治疗“痰浊阻滞型”SAP。

本研究通过网络药理学初步筛查“陈皮-半夏”的主要活性成分为naringenin（柚皮素）、nobiletin（川陈 皮 素）、coniferin（松 柏 苷）、baicalein（黄 芩 素）、beta-sitosterol（β- 谷 甾 醇）、Baicalin（黄 芩 苷）、Stigmasterol（豆甾醇）等18 个活性成分，筛选出与SAP 相 关 的 靶 点 基 因MAPK3、TP53、HSP90AA1、PPARG、JUN 等48 个。PPI 可 分 解 出 三 个 功 能 模块，三个模块中最佳评分的生物学进程为：Cellular response to chemical stress、Positive regulation of heart rate by epinephrine-norepinephrine、Blood coagulation，fibrin clot formation。GO 富集分析集中作用于regulation of tube diameter（管径调节）、blood vessel diameter maintenance（血 管 直 径 维 持）、regulation of tube size（管 尺 寸 调 节）、regulation of muscle contraction（调 节 肌 肉 收 缩）、regulation of blood pressure（调节血压）、regulation of blood circulation（调节血液循环）、adenylate cyclase-modulating G proteincoupled receptor signaling pathway（腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路）、regulation of muscle system process（肌肉系统过程）、vascular process in circulatory system（循环系统中的血管进程）、blood circulation（血液循环）等相关生物过程（biological process），KEGG 功能富集集中于Adrenergic signaling in cardiomyocytes（心肌细胞中的肾上腺素能信号）、Calcium signaling pathway（钙信号通路）、Lipid and atherosclerosis（脂质和动脉粥样硬化）、cAMP signaling pathway（cAMP 信号通路）、Apoptosis（细胞凋亡）等信号通路。这证明“陈皮-半夏”治疗“痰浊阻滞型”SAP 具有多成分、多靶点、多通路联合生效的优点。

将“药 物 成 分-SAP 靶 点- 通 路”网 络 用CytoScape 内置的Network Analyzer 分析其网络拓扑学参数可以得出：β-谷甾醇、Cavidine、川陈皮素为“陈皮- 半夏”治疗SAP 的关键活性成分；PTGS2、HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 为为“陈皮-半夏”治疗SAP 的关键靶点基因。

有实验[6]发现，Nob（川陈皮素）可能通过激活Nrf2/HO-1 信号通路抑制高糖诱导的心肌细胞肥大，减轻氧化应激损伤。也有实验[7]发现β-谷甾醇可防止中风、静脉血栓等危险事件的发生，是β-谷甾醇经过非竞争性抑制凝血酶的活性从而发挥抗凝作用，使血栓溶解。此外还有实验[8]得出，β-谷甾醇对哇巴因、乌头碱以及心肌缺血引起的心率失常有明显遏制作用。因此“陈皮-半夏”可能通过川陈皮素、β-谷甾醇治疗SAP。

有研究[9]报道，COX-2（PTGS2）靶点蛋白在炎症和动脉血栓形成中发挥关键作用，血小板聚集和局部炎症反应都是加快血栓形成的重要因素，下调COX-2 的表达能够改善可能引起血栓的细胞炎性因子变化，降低细胞炎性反应，有可能减缓冠心病动脉血栓形成。在急性心梗和冠心病患者中血清COX-2水平升高，在大鼠颈动脉血栓形成模型中COX-2 的表达在诱导血栓形成后14 天显著升高，而下调COX-2后能显著改善大鼠的症状[10]。

李琳、蔡红雁、郭涛[11]等做实验证明，心功能异常、心肌肥大和心脏重塑可由β 肾上腺素能受体信号（βA R）的长期激活引起。王彦珍、罗健东[12]发现当外界刺激或体液因子导致细胞内Ca2＋浓度升高时，通过Ca2＋／CaM 激活钙信号通路（CaN），活化的CaN 发生细胞质中的NF-AT3 去磷酸化进入细胞核等一系列反应，结果使心肌收缩蛋白基因表达上调、蛋白合成增加、细胞体积增大，心肌从而发生肥大。过表达circUK2 可通过靶向下调miR-483-5p 抑制oxLDL 诱导的血管内皮细胞氧化应激和细胞凋亡，从而减少心血管内皮细胞损伤[13]。因此推测“陈皮-半夏”治疗SAP 主要是通过β-谷甾醇、川陈皮素作用于PTGS2（COX-2）靶点蛋白刺激心肌细胞中的肾上腺素能信号、钙信号通路、细胞凋亡等信号通路来治疗SAP。

结合上述讨论可以看出，“陈皮-半夏”这一药对的同一活性成分可作用于不同靶点，而同一靶点又可调控不同生物学过程和信号通路，显现出“陈皮-半夏”治疗SAP 拥有多通路、多靶点联合作用的优点。这表明如果调控网络中的单个或多个重要靶点即可对整个网络进行调节，这为临床上使用“陈皮-半夏”治疗“痰浊阻滞”型SAP 提供了科学依据，为后续审定“陈皮-半夏”临床疗效指标提供了标准，也为发掘“陈皮-半夏”的潜在作用机制提供了新的方向。网络药理学运用网络科学的方法来研究中药多方面的药理特性，用网络拓扑性质来反馈中药有效成分的各项理化和生物学性质，为探索单味中药、中药药对、中药方剂的各种复杂作用模式提供了新的角度[14]，同时也为其在临床中的应用提供了一定的科学依据，但由于只是推论，所以仍旧需要实验来加以验证，进而明确“陈皮-半夏”治疗SAP 的主要调控靶点。