白芷治疗溃疡性结肠炎作用机制探讨

唐婕，严建

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410021

溃疡性结肠炎是一种病变在黏膜及黏膜下层形成溃疡的非特异性炎症性肠病，今年发病率逐年上升[1]，至今UC 发病原因没有文献明确阐述，其发病机制与遗传、免疫、肠道微生物与其环境的相互作用有关，临床症状主要为发热、腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重，病程日久可致癌变[2]。治疗溃疡性结肠炎的着手点在于保护肠黏膜、抗炎止血、修复肠壁溃疡、调节肠道菌群、修复平衡免疫屏障等为主[3]。西医在治疗溃疡性结肠炎常使用水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂、益生菌等，但此病病程长，治疗难度大，长期使用存在肝肾毒性、药物剂量依赖、激素撤减过程出现病情反复、机会性感染[4-5]等副作用，生物制剂效果较好但价格昂贵，长期治疗家庭经济负担重等弊端[6-8]。故患者的长期生活质量不理想[9]。

白芷味辛，性温，具散寒止痛、燥湿止带、消肿排脓的功效。现代药理学研究显示白芷有解热镇痛、消炎、抗菌以及抗肿瘤作用[10-12]，白芷主要成分香豆素类（异欧前胡内酯 （isoimperatorin）、别异欧前胡内酯（alloisoimpera-torin）、白当归脑 （byakangelicol）等）所制成的化合物作为抗凝和抗血栓药广泛运用于临床[13]。临床处方常加白芷用以治疗溃疡性结肠炎，但白芷作用于UC 的治疗机制未有人研究，本研究通过网络药理学筛选白芷活性成分、作用靶点及信号通路，从而与UC 构建潜在网络关系，推断可能作用机制，并通过分子对接进行验证。

材料与方法

1 白芷有效活性化合物及作用靶点筛选

以“白芷”为检索词，将筛选条件调整为“口服利 用 度（OB）≥30%”和“类 药 性（DL）≥0.18”，在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php） 数 据库检索白芷的有效成分及所对应蛋白质靶点，利用 Uniprot（https：//www.uniprot.org）数 据 库 选 择以“Reviewed”“Human”为条件，对蛋白质靶点转化为对应基因靶点并规范。最后将数据导入Cytoscape3.8.2，绘制“白芷-活性成分-作用靶点”图。

2 溃疡性结肠炎靶点收集

以“ulcerativecolitis”为疾病检索词，分别在Drugbank https：//www.drugbank.ca）、GeneCards （https：//）www.genecards.org）、OMIM （http：//omim.org）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）四个疾病数据库进行检索，收集溃疡性结肠炎相关靶点结果的并集。将获取的成分靶点与疾病靶点通过Venny（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）平台获取结果，并绘制韦恩图。

3 蛋白互作PPI 网络的构建

通过韦恩图获得的交集基因导入String（https：//string-db.org）数据库获取蛋白相互作用关系并构建PPI 网络，将获得的tsv 文件导入Cytoscape，利用Network S Analyze 和CytoNCA 内置插件进行网络分析筛选，最终得到核心蛋白。

4 GO 和KEGG 富集分析

将活性成分与疾病共有靶点录入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）平台，分析其细胞成分（CC），分子功能（MF），生物过程（BP）及代谢通路（KEGG）并进行富集分析，并对数据进行可视化处理。将富集分析结果导入Cytoscape 绘制“交集靶点-溃疡性结肠炎-信号通路”图。

5 分子对接

计算“活性成分- 靶点”网络图中活性成分的度值，将degree 值＞6 的3 个活性成分与查阅文献后保留的3 个密切度高的核心蛋白分子进行对接，在PubChem 数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取活性成分的2D 结构，并借助Chem3D 软件进行结构优化。PDB（http：//www.rcsb.org）数据库获取蛋白空间结构，通过AutoDockTools 软件对蛋白受体和配体进行去水、加氢等处理后，AutoDock-Vina 进行分子对接计算结合能，Pymol 进行数据可视化处理。

结 果

1 白芷有效活性化合物及靶点筛选

经TCMSP 数据库，以OB＞30%，DL＞0.18 为条件，共获得活性成分22 种，作用靶点158 个，在uniprot 规范后最终获得基因靶点61 个，对应有效化合物10 种，具体对应情况见表1，其潜在作用见图1。

图1 白芷成分-靶点图

表1 白芷有效成分

2 溃疡性结肠炎靶点整合

将4 个数据库检索的溃疡性结肠炎靶点进行整合，Drugbank 获得58 个 Genecards 筛选后获得1208个，OMIM 获得191 个，TTD 获得39 个，去除重复值得到1329 个疾病基因。取疾病与药物靶点的交集，获得17 个共有基因，见图2。

图2 药物-疾病Vene 图

3 蛋白互作PPI 网络的构建

将获得的数据录入String 进行网络分析，得到17个节点，51 条边，平均Degree 值为6，平均局部聚类系数为0.744，预期边数为11，PPI 富集p 值为＜ 1.0e-16，见图3。将获得的数据导入Cytoscape3.8.2，使用Network Analyze 功能，根据Degree＞6 筛选得到8 个基因核心互作网络。

图3 交集靶点PPI

4 GO 富集分析

通过Metascape 数据库进行GO 富集分析，得到972 条生物过程（BP），主要与对雌二醇的反应、对无机物质的反应、管形态发生、对伤害的反应、对有毒物质的反应、对激素的反应、凋亡信号通路、成纤维细胞增殖的调节、细胞周期的负调节、血液循环、伤口愈合等功能相关；得到15 条细胞组成（CC），主要为膜筏、细胞器外膜、黏着、转录调节因子复合物、细胞体；分析得到78 条分子功能（MF），主要为半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡的执行阶段、蛋白质均质二聚活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白酶结合、蛋白激酶结合、泛素蛋白连接酶结合、脂质结合。根据富集基因数目绘制气泡图，见图4。

图4 GO 分析气泡图

5 KEGG 富集通路分析

通过Metascape 数据库进行KEGG 通路富集分析，共得到富集通路84 条，结果显示基因主要富集在乙型肝炎、结直肠癌、小细胞肺癌、人T 细胞白血病病毒1 型感染、内分泌抵抗、5-羟色胺能突触、癌症蛋白聚糖、胰腺癌、微核糖核酸、癌症转录失调，见图5。使用Cytoscape3.8.2 绘制“关键靶点-溃疡性结肠炎-信号通路”，见图6。

图5 KEGG 信号通路气泡图

图6 关键靶点筛选

6 分子对接分析

为了进一步佐证并预测白芷与UC 的作用机制，使用AutoDock Vina 软件进行分子对接，将度值最高的3 个活性 成分（beta-sitosterol、Stigmasterol、Prangenidin）经查阅文献后与3 个密切度较高的蛋白（CASP3、PTGS2、BAX）进行分子对接，见图7。据相关文献研究成分与蛋白结合自由度能小于-5kcal/mol认为二者结合稳定。结果显示活性成分与蛋白结合能均＜-6kcal/mol，见表2。以上对接结果表明了白芷有效活性成分与溃疡性结肠炎的靶点基因有着很好的结合作用。

图7 分子对接示意图

表2 白芷活性成分与UC 靶基因对接评分表

讨 论

溃疡性结肠炎已被WTO 列入国际难治性疾病和终身型疾病，现在认为发病原因主要是肠道屏障的破坏、肠道微生物菌群失调与免疫屏障的失衡有关，故主要治疗途径，主要通过肠道屏障，微生物途径，免疫屏障途径着手。多项研究表明美沙拉嗪、肠道益生菌、西药对溃疡性结肠炎的病情发展控制效果不太理想，药物副作用不可避免。在此同时，有研究证实中药对溃疡性结肠炎的病情控制及症状的缓解均取的了良好的疗效，且不良反应少。溃疡性结肠炎病情的发生发展受到多种条件因素的影响，多种细胞成分及多条通路的调控。白芷在现代药理学研究中证实有消炎、镇痛、抗菌、止血、抗肿瘤的作用，但对于治疗UC 的作用机制尚不明确。本研究通过网络药理学收集白芷主要活性成分作用靶点与UC 疾病靶点筛选后发现其作用关系并通过分子对接技术证实其可行性，探讨其可能作用机制。

笔者通过网络药理学由药物-成分-靶点图可知白芷所含主要成分为β- 谷甾醇、豆甾醇、别欧前胡素。相关研究表明β-谷甾醇可以以浓度依赖的方式降低实验性结肠炎小鼠肠道组织中促炎因子TNF-α，IL-6 和IL-1β 的水平。还可以治疗肠上皮细胞，可显著增加抗菌肽的表达并降低细胞内鼠伤寒沙门氏菌的存活率[14]，显示了β-谷甾醇对致病菌的多种作用。炎症性肠病（IBD）伴有肠道微生物群失衡和调节性T（Treg）/T 辅助者17（Th17）免疫失衡。有关研究显示，豆甾醇已显示出抗炎作用，豆甾醇可以增强肠道微生物群衍生的短链脂肪酸（SCFAs）尤其是丁酸盐的产生，丁酸盐介导的PPARγ 激活恢复了Treg / Th17 细胞的平衡，豆甾醇还可以改变葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中的肠道微生物群[15]。β-谷甾醇和豆甾醇均显著抑制结肠缩短，降低粪便血红蛋白含量及结肠中远端结肠炎的严重程度（P＜0.05）。明显抑制了核因子kappa B 的激活，还降低了集落刺激因子-1 和炎症主调节因子-kappa B 的核易位。豆甾醇显着降低了结肠炎症评分以及环加氧酶-2 和集落刺激因子-1 的表达，而β-谷甾醇则较低或无效[16]。可以推测通过这些机制，β-谷甾醇、豆甾醇可以对IBD 起到治疗作用。别欧前胡素在多种癌症模型中均表现出抗肿瘤活性作用，如肺癌，胃癌，乳腺癌，诱导急性髓系白血病HL-60 细胞凋亡等[17]。目前别欧前胡素对于肠道疾病方面研究尚少，可作为今后研究突破点。

根据网络药理学PPI 的数据结果，白芷作用于溃疡性结肠炎的关键靶点为CASP3、BAX、CASP8、BCL-2、CASP9、PTGS2、ESR1 等。半 胱 天 冬 酶-3（CASP3）编码的蛋白质是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡执行阶段起核心作用[18]。相关研究表明：炎症性肠病患者的肠道组织通过减少屏障蛋白闭塞素的表达从而限制了CASP3 表达并防止通过内源途径（由5-氟尿嘧啶刺激）或外源途径（由肿瘤坏死因子刺激）诱导细胞凋亡，并降低了肠上皮细胞对凋亡的敏感性，可能促进炎症性疾病后黏膜稳态的恢复[19]。PTGS2 编码环氧合酶-2（COX-2），肠道炎症反应由于各种原因引发后刺激COX-2 表达增加，而COX-2 可促使花生四烯酸转化为PGE2，PGE2 作为前列腺素和血栓素的前体，其生成的增加从而促使炎症反应进一步加重，相关研究表明在溃疡性结肠炎的活动期PGE2 血清浓度及尿液中的浓度均明显上升[20-21]，促进肠道毛细血管舒张、产热、产痛，作用于周围神经末梢的EP1、EP2 受体，增加膜兴奋性，进而激活痛觉感受器，引发或加重腹痛。白芷通过其主要成分呋喃香豆素通过抑制COX-2 调节花生四烯酸的代谢途径[22]，PTGS2 编码COX-2 减少，使得前列腺素、PGE2 合成减少，从而抑制炎结肠组织中的炎症，从而起到治疗UC 的效果。BAX 是编码的蛋白质属于BCL2 蛋白质家族，作为各种细胞活动的促凋亡调节剂，在线粒体的凋亡过程中发挥作用[23-26]，可通过促进CASP3 的激活，从而促进细胞凋亡[24-25，27]。相关研究表明，通过抑制COX-2、NF-κB 以及BAX和CASP3 凋亡蛋白的表达，来增加抗凋亡蛋白，抑制Bcl-2 的凋亡，减少肠上皮细胞的凋亡来维持肠黏膜屏障的稳定性来治疗UC[28]。相关研究表明，BAX 还与结直肠癌相关[29-31]。

从GO 分析里可知白芷通过影响肠道组织细胞的凋亡通路、对细胞周期的负调节、成纤维细胞增殖的调节、对局部伤口的愈合，局部血液循环实现参与细胞凋亡的执行阶段、蛋白质均质二聚活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白酶结合、蛋白激酶结合、泛素蛋白连接酶结合、脂质结合从而影响肠上皮组织连续性，影响肠黏膜屏障的稳定性。通过这复杂的过程来治疗溃疡性结肠炎。

从KEGG 结果中可知白芷主要富集在乙型肝炎、结直肠癌、小细胞肺癌、人T 细胞白血病病毒1 型感染、内分泌抵抗、5-羟色胺能突触、癌症中的蛋白聚糖、胰腺癌、癌症中的微核糖核酸、癌症中的转录失调中。IBD 的致病因素中，肠道组织的炎症性免疫应答反应发挥核心作用，同时免疫炎性反应也受到复杂的多方面因素调节，mi-RNA 在人体中广泛存在，UC 特异相关性mi-RNA 的表达对UC 疾病的发生发展具有极大的相关性[32]。mi-RNA143 可以通过结合靶向自噬相关蛋白同源体2 基因上的3-UTR，来干扰肠上皮细胞的自噬作用，从而增强肠道组织的局部炎症[33]，mi-RNA21 基因敲除后的小鼠与正常小鼠肠道菌群构成存在明显差异，其通过影响定植的肠道菌群来促进UC 的发生，还可以通过作用于PTEN/NF-κB 信号通路的表达来影响肠道菌群定植和肠道炎症的进展[34]。根据相关研究表明溃疡性结肠炎与结直肠癌的发生存在必然联系[35-37]。但相关机制阐明尚未明确，mi-RNA 在其中的作用机制只基于单个通路，相关研究表示在IBD 相关性结直肠癌发生发展中，miRNA-29a-5p/STAT3 信号轴发挥着重要作用，其正反馈作用通路可通过放大炎症作用，抑制DNA 羟甲基化酶10-11转位蛋白（TET）的表达[38]，mi-RNA-155 通过降低在多种肿瘤发生中起重要作用的靶蛋白HIF-1α 表达最终导致IBD 相关性结直肠癌发生[39]。mi-RNA 对于 UC 乃至IBD 从多角度多途径的方式诱导其发生发展，其中的机制及对应治疗值得我们进一步探索。笔者推测白芷可通过mi-RNA 这一通路作用于UC，通过调节肠道菌群，减轻肠道炎性反应，调节其免疫反应，从而达到降低其发生、减缓其发展的作用。

3 个主要化合物与核心靶点靶基因的分子对接显示：β-谷甾醇、豆甾醇、别欧前胡素与核心靶基因CASP3、PTGS2、BAX 结合性较好，进一步佐证了网络药理学筛选的合理与可行性。

本研究基于网络药理学、生物信息学与虚拟分子对接的方法预测白芷单味重要治疗UC 的作用机制，研究结果在一定研究基础上阐明了白芷通过多成分、多靶点、多通路的共同作用治疗UC 的作用机制，但由于白芷单味药治疗UC 的实验研究尚少，且本研究仅从理论上探讨白芷治疗UC 的作用机制，缺乏实验数据验证，后续还将采用实验的方式加以佐证本次理论预测，也将加以复方的方式加以研究，为治疗UC 开发新思路、新方法。