骨质疏松患者Th17/Treg细胞平衡状况及其与骨代谢指标的相关性

付海宁，丁晓明，李新宇，高博，陆雪颖，梁冠文

1.宝鸡市妇幼保健院检验科，陕西 宝鸡 721000；

2.宝鸡市妇幼保健院内科，陕西 宝鸡 721000；

3.宝鸡市人民医院骨二科，陕西 宝鸡 721000

骨质疏松累及全身骨骼，其基本病理特征表现为骨量丢失、骨微结构变化、骨小梁坍塌，不仅会增加骨骼脆性，还会加大骨折发生风险[1]。相关文献显示，辅助性T 细胞17(T helper cell 17，Th17)会产生阻碍骨吸收细胞生长及激活的相关因子，从而在骨质疏松过程中发挥作用[2]。调节性T细胞(regulatory cell，Treg)能发挥免疫抑制作用，对骨质破坏进行抑制[3]。正常骨代谢指的是骨形成(成骨细胞介导)同骨吸收(破骨细胞介导)间的平衡过程，且在生理下破骨细胞与成骨细胞一起对正常骨转化进行控制，进而保持骨稳态，骨代谢的不平衡就会引发骨疾病，于骨质疏松发展期间，骨代谢也发挥重要作用[4-5]。相关文献显示，在分化发育期间，Th17、Treg被诸多细胞因子调控，对机体免疫应答进行参与，经分化、激活成骨与破骨细胞对骨代谢进行干扰[6]。目前，Th17、Treg 细胞平衡于骨质疏松中的具体机制还不明确。基于此，本研究旨在探讨Th17、Treg 细胞平衡在骨质疏松患者中的表达意义及其与骨代谢指标的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2019年3月至2022年2 月在宝鸡市妇幼保健院诊治的120 例骨质疏松患者(骨质疏松组)的临床资料。纳入标准：(1)同骨质疏松相关诊断标准[7]相符；(2)骨密度T 值不足2.5 SD；(3)年龄超过18岁；(4)临床资料完整。排除标准：(1)伴有肾、肝功能不全；(2)伴有类风湿、原发性甲亢、糖尿病等干扰骨代谢的疾病；(3)6 个月内使用过干扰骨代谢的药物。另选择同期在本院进行体检的健康者100例作为对照组。骨质疏松组中男性51 例，女性69 例；年龄52～76 岁，平均(63.83±6.15)岁。对照组中男性42例，女性58 例；年龄54～78 岁，平均(64.14±6.33)岁。两组受检者性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 观察指标与检测方法 (1)Th17、Treg：Th17检测：收集所有受检者空腹状态下4 mL 全血，选择乙二胺四乙酸进行抗凝，并在60 min 内提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，置入佛波醇乙酯、离子霉素、莫能霉素进行刺激，在二氧化碳(carbon dioxide，CO2)细胞培养箱培养4 h，之后置入藻红蛋白-抗人CD8 mAb 及经异硫氰酸荧光素染色后的抗人CD3 mAb，固定液置入后破膜，再置入PERCP-CY5.5 抗人白介素-17A (interleukin-17A，IL-17A)及200 μL 固定液，上机检测。Treg 检测：收集所有受检者空腹状态下3 mL全血，选择乙二胺四乙酸进行抗凝，并在60 min内提取PBMCs，避光后，置入藻红蛋白-抗人CD8 mAb及经异硫氰酸荧光素染色后的抗人CD3 mAb，在CO2细胞培养箱培养1 h，将同定液置入，等待1 h，置入穿膜液，再等待1 h，置入PERCPCY5.5 抗人牛叉头型基因P3 (Forkhead Box P3，FOXP3) FOXP3 后孵育2 h，将200 μL 固定液置入，上机检测。(2)骨代谢炎性细胞因子指标：收集所有受检者空腹状态下5 mL肘静脉血，以3 000 r/min的速度离心10 min，使用酶联免疫吸附法检测骨代谢炎性细胞因子指标[包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、转 化 生 长 因 子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)]。(3)骨代谢蛋白酶活性指标：使用酶联免疫吸附法检测所有受检者的骨代谢蛋白酶活性指标[包括基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(collagenⅠcross-linked carboxy terminal telopeptide，ICTP)、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(procollagen I of aminoterminal propeptide，PINP)]。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0 统计软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，采用Spearman 相关性分析Th17、Treg 与骨代谢指标的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的Th17、Treg水平比较 骨质疏松组患者的Th17水平明显高于对照组，Treg水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组受检者的Th17、Treg水平比较(±s，%)Table 1 Comparison of Th17 and Treg levels between the two groups(±s,%)

表1 两组受检者的Th17、Treg水平比较(±s，%)Table 1 Comparison of Th17 and Treg levels between the two groups(±s,%)

组别骨质疏松组对照组t值P值例数120 100 Th17 2.30±0.41 1.43±0.35 16.978 0.001 Treg 3.18±0.78 4.47±0.63 13.568 0.001

2.2 两组受检者的骨代谢炎性细胞因子水平比较 骨质疏松组患者的TNF-α、IL-6 水平明显高于对照组，IL-10、TGF-β水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 两组受检者的骨代谢炎性细胞因子水平比较(±s)Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in bone metabolism between the two groups(±s)

表2 两组受检者的骨代谢炎性细胞因子水平比较(±s)Table 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in bone metabolism between the two groups(±s)

组别骨质疏松组对照组t值P值例数120 100 TNF-α(ng/mL)7.63±1.05 3.36±0.47 39.998 0.001ⅠL-6(pg/mL)33.60±5.35 20.34±3.28 22.539 0.001ⅠL-10(pg/mL)16.61±2.19 29.51±3.55 31.663 0.001 TGF-β(pg/mL)21.39±6.11 40.47±10.35 16.228 0.001

2.3 两组受检者的骨代谢蛋白酶活性指标比较 骨质疏松组患者的MMP-2、ICTP水平明显高于对照组，PINP 水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 两组受检者的骨代谢蛋白酶活性指标比较(±s，ng/mL)Table 3 Comparison onthelevels ofbonemetabolicprotease activity indexesbetweenthetwo groups(±s,ng/mL)

表3 两组受检者的骨代谢蛋白酶活性指标比较(±s，ng/mL)Table 3 Comparison onthelevels ofbonemetabolicprotease activity indexesbetweenthetwo groups(±s,ng/mL)

组别骨质疏松组对照组t值P值120 100 912.36±109.82 648.59±75.28 21.040 0.001 6.50±0.84 4.02±0.56 26.118 0.001 0.85±0.13 1.44±0.20 25.370 0.001例数MMP-2ⅠCTP PⅠNP

2.4 Th17、Treg与骨代谢指标的相关性 经Spearman分析结果显示，Th17 与TNF-α、MMP-2、ICTP 呈正相关(P＜0.05)，Treg 与TNF-α、MMP-2、ICTP 呈负相关(P＜0.05)，与TGF-β呈正相关(P＜0.05)，见表4。会促进人核因子KB受体活化因子配体(human nuclear factor KB receptor activator Ligand，RANKL)分泌及破骨细胞活化，从而使破骨细胞中的蛋白酶水平增加，介导骨降解过程[11]。相关文献显示，骨质疏松患者的Th17呈现出过度活化的状态，然而其对蛋白酶活性及炎性反应的干扰机制还不明确[12]。有文献显示，Treg细胞经负反馈对破骨细胞的分化、形成进行抑制，在骨代谢平衡中发挥关键作用[13]。Treg细胞通过其重要转录因子Foxp3 经分泌IL-10、TGF-β 等细胞因子发挥调节免疫机制的作用，进而参与破骨抑制，降低骨吸收量[14]。本研究显示，骨质疏松患者的Th17水平明显高于健康体检者，Treg水平明显低于健康体检者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示骨质疏松患者可能出现Th17/Treg 平衡失衡。骨质疏松患者Th17 水平提升、Treg水平降低，可能是因为Th17能够加快炎性细胞大量分泌RANKL，而RANKL又能够在破骨细胞前发挥作用，进而对破骨分化进行诱导。

表4 Th17、Treg与骨代谢指标的相关性Table 4 Correlation analysis of Th17, Treg and bone metabolism indexes

本研究还显示，参与骨代谢的相关炎性细胞因子，像TNF-α、IL-6水平明显升高，IL-10、TGF-β水平明显降低，TNF-α、IL-6能够诱导初始T细胞分化为Th17细胞，进而分泌大量IL-17，最终形成链式效应，进一步加重骨质疏松，IL-10、TGF-β降低主要是由于Treg水平的降低导致其分泌的IL-10、TGF-β对应减少。且本研究经Spearman分析显示，Th17同TNF-α呈正相关，Treg同TNF-α呈负相关，同TGF-β呈正相关。

MMP-2 属于基质金属蛋白酶中Ⅰ型胶原介导水解的一种重要催化酶，在骨骼Ⅰ型胶原的降解及合成过程中会出现诸多不良产物，PINP为Ⅰ型胶原前体发生裂解、产生成熟Ⅰ型胶原期间的产物，可反映胶原合成活力，ICTP属于型胶原水解期间脱落羧基末端的产物之一，可反映胶原降解活力[15-16]。本研究显示，骨质疏松患者的MMP-2、ICTP 水平明显高于健康体检者，PINP 水平明显低于健康体检者，差异均有统计学

3 讨论

骨质疏松属于骨病综合征之一，它以骨微结构破坏、骨量降低为病理学典型表现，临床中呈现为骨强度衰退、骨脆性提升等，会增加人体低能量性骨折的发生率[8]。在宏观层面上，临床特征表现为个子变矮、驼背、浑身疼痛等腰椎变形，严重者还会引发骨折、残疾，甚至是死亡[9]。骨质疏松发病期间，会过度激活炎性反应及增加蛋白酶活性，这会直接影响骨代谢期间的骨吸收与形成，目前，调控蛋白酶活性及炎性反应的机制还尚未明确[10]。

Th17属于人体中比较重要的一种CD4+T 细胞亚群，于维甲酸相关孤核受体γt(retinoid-relatedorphanreceptorgammat，RORγt)转录因子的介导作用下分化、成熟，同时会分泌大量IL-17。IL-17促炎活性极强，可以使炎性反应激活，同时干扰骨代谢，除此之外，IL-17还意义(P＜0.05)。提示于骨质疏松发病期间，蛋白酶活性明显增加，胶原合成产物减少、裂解产物增多。基于此，经Spearman 分析显示，Th17 同MMP-2、ICTP 为正相关关系，Treg同MMP-2、ICTP为负相关关系，提示骨质疏松发病期间，Th17的活化过度可使蛋白酶活性增强，进而加快骨基质中的胶原降解，Treg的降低会提升胶原降解活力。

综上所述，骨质疏松患者的Th17 水平提升，Treg表达水平降低，它们共同干扰骨代谢期间的炎性反应与蛋白酶活性。