老年结肠癌合并2型糖尿病及结肠腺瘤RAGE、VEGF、TGF-β1的表达水平与生存状况的相关性

曹竣植，童敏思，祝毛玲，王保才，史惠惠，臧意，马静，李力

同济大学附属杨浦医院(上海市杨浦区中心医院)消化科，上海 200090

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，流行病学调查显示其病死率、发病率逐年增高、居高不下，且呈现逐渐年轻化趋势[1]。近年来有研究证实，结肠癌与糖尿病之间存在密切联系，糖尿病在发病率、预后方面均对结肠癌具有重要影响[2]。但目前关于糖尿病，尤其是2型糖尿病导致结肠癌发病率升高的作用机制尚未明确，一般认为与机体高血糖状态引发机体氧化应激反应有关[3]。2 型糖尿病患者体内晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在机体高血糖状态引发机体氧化应激反应中功不可没，不仅刺激产生氧自由基，还促进多种细胞因子如转化生长因子β1蛋白(TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)大量释放，因此在肿瘤细胞中多呈高表达[4]。为进一步探究机体高血糖状态与氧化应激反应之间的关系，本文将检测老年结肠肿瘤患者的RAGE、VEGF、TGF-β1表达水平，以探究其与临床指标的关系以及对生存期的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年5 月至2020 年5 月同济大学附属杨浦医院收治的100例老年结肠肿瘤患者进行研究。纳入标准：(1)结肠镜、手术取标本后经病理检查确诊为结肠癌者；(2)符合世界卫生组织(WHO)[5]关于糖尿病的相关诊断标准者；(3)纳入研究前3个月未接受过化疗、放疗、靶向治疗者；(4)纳入研究前3个月无肠道术史者；(5)对本研究知情同意并签署相关同意书者。排除标准：(1)合并妊娠期、1型糖尿病或因内分泌导致的糖尿病者；(2)合并免疫系统严重疾病者；(3)合并严重肝、心、肾疾病者。所有患者按照疾病类型分为结肠癌合并2 型糖尿病组(n=32)、结肠癌组(n=33)及结肠腺瘤组(n=35)。三组患者的临床病理分期、肿瘤部位、浸润深度比较差异均无统计学意义(P＜0.05)，具有可比性，见表1。本研究经我院医学伦理委员会批准。

表1 三组患者的一般资料比较[±s，例(%)]Table 1 Comparison of general data of patients among three groups[±s,n(%)]

表1 三组患者的一般资料比较[±s，例(%)]Table 1 Comparison of general data of patients among three groups[±s,n(%)]

指标年龄(岁)男/女临床病例分期A期B期C期D期浸润深度全层肌层黏膜肿瘤部位脾曲部降结肠横结肠回盲部升结肠肝曲部乙状结肠结肠癌组(n=33)71.79±3.02 21(63.64)/12(36.36)2(6.06)26(78.79)3(9.09)2(6.06)23(69.70)8(24.24)2(6.06)1(3.03)3(9.09)3(9.09)4(12.12)7(21.21)7(21.21)8(24.24)结肠腺瘤组(n=35)72.25±3.30 24(68.57)/11(31.43)2(5.71)25(71.43)5(14.29)3(8.57)26(74.29)6(17.14)3(8.57)2(5.71)3(8.57)4(11.43)5(14.29)5(14.29)7(20.00)9(25.71)结肠癌合并2型糖尿病组(n=32)72.19±3.18 22(68.75)/10(31.25)1(3.13)25(78.13)4(12.50)2(6.25)24(75.00)6(18.75)2(6.25)1(3.13)3(9.38)2(6.25)5(15.63)6(18.75)7(21.88)8(25.00)F/Z/χ2值0.256 0.252 1.067 0.730 1.564 P值0.880 0.882 0.983 0.948 0.999

1.2 方法

1.2.1 所用试剂 鼠抗人VEGF 单克隆抗体，购自福州迈新公司；兔抗人TGF-β1多克隆抗体、兔抗人RAGE 多克隆抗体及全套免疫组化试剂，购自武汉博士德公司。

1.2.2 检测方法 所有患者采集肿瘤病灶组织及病灶周围组织制作标本，对病理切片行常规脱蜡后入水，应用0.3%的H2O2对内源性过氧化物酶进行阻断，封闭切片应用10%小牛血清，滴加1∶200稀释的一抗，置于4℃环境24 h；次日1 h复温，磷酸缓冲盐溶液(PBS)水洗后滴加1∶200的二抗，显色应用二氨基联苯胺(DAB)，完成显色后于显微镜下进行观察，梯度酒精行脱水，胞核行苏木精复染，二甲苯透明，树胶封片。阴性对照为PBS替代一抗，武汉博士德公司提供阳性对照。

1.2.3 分析方法 各目的抗原在肿瘤组织中的表达情况应用半定量法定量分析。在高倍显微镜(×500)下随机选择5个视野也即500个细胞，计算阳性细胞比例。0 分：阳性细胞数在5%以下；1 分：阳性细胞数在5%～24%；2 分：阳性细胞数在25%～50%；3分：阳性细胞数在51%～74%；4 分：阳性细胞数在75%以上。观察切片中阳性细胞着色情况及强度：0 分，无色；1分，淡黄的；2分，棕黄色；3分，棕褐色。最终表达情况以比例和着色强度计分相加，0分：阴性(-)；1～2分：弱阳性(+)；3～5分：中等阳性(++)；6～7分：强阳性(+++)。

1.3 随访 通过电话、QQ、微信、电子邮件、信件等方式随访以掌握患者的病情、预后情况，随访时间间隔为3个月。随访截至时间为2022年5月。

1.4 观察指标 比较结肠癌病理组织标本中RAGE、VEGF、TGF-β1表达情况；分析RAGE、VEGF、TGF-β1表达与年龄、肿瘤直径、远处转移的关系；分析RAGE、VEGF、TGF-β1表达与生存期的相关性，其中生存期分为无复发生存期(RFS)：期间肿瘤无复发、转移；总生存期(OS)：期间患者无死亡。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0 软件进行数据统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验，采用单因素回归分析RAGE、VEGF、TGF-β1与年龄、肿瘤直径、远处转移的关系，采用Spearman 相关性分析法分析RAGE、VEGF、TGF-β1表达与生存期间的相关性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌病理组织标本中RAGE、VEGF、TGF-β1表达情况 RAGE、VEGF、TGF-β1在结肠癌、结肠腺瘤以及结肠癌合并2 型糖尿病中均有表达(图1～图6)，且主要集中在癌症细胞质内，主要位于固有腺上皮、癌旁黏膜上皮、癌细胞胞浆中；其中结肠癌合并2 型糖尿病组RAGE、VEGF、TGF-β1阳性高表达率明显高于结肠癌组和结肠腺瘤组，且结肠癌合并2 型糖尿病组RAGE、VEGF、TGF-β1阳性表达率也明显高于结肠癌组和结肠腺瘤组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

图1 RAGE在结肠癌中表达(×500)Figure 1 Expression of RAGE in colon cancer(×500)

图2 RAGE在结肠腺瘤中表达(×500)Figure 2 Expression of RAGE in colon adenoma(×500)

图3 RAGE在糖尿病合并结肠癌中表达(×500)Figure 3 Expression of RAGE in diabetes with colon cancer(×500)

图4 VEGF在结肠癌中表达(×500)Figure 4 Expression of VEGF in colon cancer(×500)

图5 VEGF在结肠腺瘤中表达(×500)Figure 5 Expression of VEGF in colon adenoma(×500)

图6 VEGF在糖尿病合并结肠癌中表达(×500)Figure 6 Expression of VEGF in colon cancer combined with type 2 diabetes(×500)

表2 三组结肠癌病理组织标本中RAGE、VEGF、TGF-β1表达水平比较[例(%)]Table 2 Comparison of RAGE,VEGF,TGF-β1 in pathological tissue samples among the three groups[n(%)]

2.2 RAGE、VEGF、TGF-β1表达与临床指标的关系 RAGE、VEGF、TGF-β1表达与年龄、肿瘤直径无关(P＞0.05)；RAGE、VEGF、TGF-β1表达与结肠癌癌细胞组织远处转移有关(P＜0.05)，见表3。

表3 RAGE、VEGF、TGF-β1表达与临床指标的关系[例(%)]Table 3 The relationship between the expression of RAGE,VEGF,TGF-β1 and clinical indicators[n(%)]

2.3 三组患者的RFS、OS 比较 三组患者的RFS、OS比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且结肠癌合并2型糖尿病组RFS、OS均明显短于结肠腺瘤组和结肠癌组，结肠腺瘤组明显短于结肠癌组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 三组患者的RFS、OS比较(±s，d)Table 4 Comparison of RFS and OS among the three groups(±s,d)

表4 三组患者的RFS、OS比较(±s，d)Table 4 Comparison of RFS and OS among the three groups(±s,d)

注：与结肠癌组比较，aP＜0.05；与结肠腺瘤组比较，bP＜0.05。Note: Compared with colon cancer group,aP＜0.05; Compared with the colon adenoma group,bP＜0.05.

组别结肠癌组结肠腺瘤组结肠癌合并2型糖尿病组t值P值OS 335.19±49.29 362.19±55.12a 303.15±35.17ab 6.299 0.043例数33 35 32 RFS 203.14±101.52 289.46±146.29a 181.04±93.09ab 7.607 0.022

2.4 RAGE、VEGF、TGF-β1表达与RFS、OS 的相关性 采用Spearman 相关性分析显示，结肠癌患者RAGE、VEGF、TGF-β1表达与RFS、OS 呈负相关(P＜0.05)，见表5。

表5 RAGE、VEGF、TGF-β1表达与RFS、OS的相关性Table 5 Correlation between RAGE,VEGF,TGF-β1 expression and RFS,OS

3 讨论

糖尿病是一种机体营养和代谢紊乱性疾病，发病机制与胰岛素分泌不足有关，同时该病累及机体所有系统代谢，严重影响患者生存质量和生命健康。美国糖尿病学会和癌症学会联合发布的报告中指出，糖尿病在增加结肠癌、肝癌、子宫内膜癌患病方面具有积极作用[6]。根据相关流行病学调查也发现，我国糖尿病发病率和致死率与结肠癌的发病率与致死率具有一致性，加上糖尿病患者机体高糖特性对癌细胞具有快速复制的作用，复制后还能作为能量场帮助癌细胞远处转移，且葡萄糖转化过程能引发正常细胞凋亡、坏死，进一步促进癌细胞远处转移[7]。

癌细胞在转移过程中产生大量的晚期糖基化终产物，且该终产物不可逆，虽然其在正常人体内也会随着年龄不断增长，但因该终产物受体RAGE在人体器官淋巴细胞、组织、平滑肌细胞、内皮细胞内均广泛存在，因此其水平在糖尿病患者机体内异常旺盛，与癌细胞结合可能产生相关生理、病理学改变，导致细胞坏死、损伤[8]。VEGF是一种高度特异性促血管生长因子，主要参与新血管生成和调控，与结肠癌形成具有一定相关性，同时参与肿瘤的转移、侵袭[9]。TGF-β1则具有调解上皮细胞生长、调控肿瘤发生进展、调控细胞周期等作用，一般情况下恶性肿瘤均存在TGF-β信号通路异常情形[10]。

有研究结果表明，结肠癌合并2 型糖尿病患者机体内晚期糖基化终产物结合RAGE 后能激活细胞增殖、凋亡，刺激VEGF、TGF-β1过度表达；也能增强结肠癌、黑色素瘤、胰腺癌等癌细胞生成、转移[11-12]。本研究中，通过对结肠肿瘤患者RAGE、VEGF、TGF-β1表达水平检测发现，RAGE、VEGF、TGF-β1在单纯结肠癌及结肠腺瘤中的表达水平明显低于在结肠癌合并2 型糖尿病中的表达水平，这与上述研究结果基本一致，且分析原因发现RAGE、VEGF、TGF-β1的高表达可能与2型糖尿病患者结肠癌发病率更高有一定相关性，且与肿瘤TNM 分期、癌组织分化程度、淋巴结转移等也具有一定相关性[13]。同时，本研究结果显示，RAGE、VEGF、TGF-β1表达与肿瘤直径、年龄无关，与结肠癌癌细胞组织远处转移有关，高表达RAGE、VEGF、TGF-β1的患者较低表达患者更易发生远处转移，这可能是因为高表达RAGE、VEGF、TGF-β1可有效抑制血管内皮细胞凋亡，降低内分泌治疗及化疗的效果，最终发生远处转移。

此外，通过观察不同肿瘤患者RFS、OS发现，结肠癌合并2型糖尿病患者RFS、OS明显短于结肠腺瘤组和结肠癌组，结肠腺瘤患者明显短于结肠癌患者；进一步研究结果显示，结肠癌患者RAGE、VEGF、TGFβ1表达与RFS、OS 呈负相关，表明高表达RAGE、VEGF、TGF-β1的患者生存期更短。原因可能是高表达RAGE、VEGF、TGF-β1在肿瘤细胞生长过程中能抑制细胞生长因子、周期蛋白活性，从而促进肿瘤增殖，同时促进血管生成，加速肿瘤细胞进一步演变，最终导致肿瘤细胞快速生成并转移[14-15]。

综上，RAGE、VEGF、TGF-β1在结肠癌组织中均有表达，其与患者生存期呈负相关，因此可将其作为诊断结肠癌、判断预后的重要指标。