SPRY4遗传多态性与中国汉族人群青少年特发性脊柱侧凸相关：一项单中心回顾性研究

吴增玉，张跃川，彭 越，吴 南，邱贵兴，庄乾宇，仉建国

中国医学科学院北京协和医院骨科，北京100730

青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)是一种以脊柱三维畸形为主要特征的骨科疾病，多发生于10～18岁青少年，其约占所有脊柱侧凸的90%，影响1%～3%青少年的身心健康[1-2]。该病具有一定的遗传倾向性，但具体病因未明，且存在明显的Carter效应，女性发生率约为男性的2～10倍，可能与多基因遗传模式相关，男性需更大的遗传负荷才会发病[3]。

SPRY4基因属于可编码富含半胱氨酸和脯氨酸蛋白质家族的成员之一，具有调控生长发育的作用。本团队前期研究发现，AIS患者骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中SPRY4水平显著下调，敲低SPRY4或SPRY4表达缺失可损害MSCs向成骨细胞分化，导致骨骼发育异常，可能为AIS的诱发因素[4]。此外，本研究团队在AIS患者MSCs中发现54个既往未被识别的差异性表达的微RNA(microRNA，miRNA)，其可通过多种信号通路调控MSCs分化[5]。由于SPRY4基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)亦可影响MSCs分化，推测其可能通过与miRNA相结合，进而发挥影响MSCs分化、促进AIS发病的效应。miRNA主要与3′非编码区(3′untranslated region，3′UTR)结合[6]，此区域不仅可在调节 mRNA 定位方面发挥重要作用[7]，同时是调控 mRNA 稳定性、正确时空翻译的重要结构[8]，有助于揭示人类疾病和进化的因果关系[9]。本研究针对3′UTR区域位点，首次探究了中国汉族人群SPRY4基因多态性与AIS的相关性，以期为AIS病因学研究提供新的证据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究为回顾性分析，研究对象为2017年12月—2021年12月北京协和医院AIS患者及健康受试者。AIS患者纳入标准：(1)依据临床表现及正侧位X线片确诊为AIS且Cobb角>20°；(2)发病年龄为10～18岁；(3)中国北方地区(黄河以北的区域，如河北省、山东省、山西省、北京市和天津市等)汉族人群。排除标准：(1)合并其他原因导致的脊柱畸形；(2)影像学资料不完整；(3)合并影响骨骼发育的慢性疾病。

健康受试者纳入标准：(1)体检健康，无研究相关疾病；(2)中国北方地区汉族人群；(3)按照年龄、性别与AIS患者进行1∶1匹配。排除标准：(1)全脊柱X线片、MRI等影像学资料不完整者；(2)合并影响骨骼发育的慢性疾病。

本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(审批号：JS-3403)，并豁免患者知情同意。

1.2 研究方法

收集AIS患者的AIS分型及AIS患者与健康受试者年龄/性别信息、SPRY4基因测序结果。AIS主流的手术分型包括King分型、Lenke分型及PUMC分型，其中以PUMC分型的可信度和可重复性最佳，且适合脊柱三维矫形，其将AIS分为Ⅰ型(单弯)、Ⅱ型(双弯)和Ⅲ型(三弯)[10]。本研究根据全脊柱X线片，记录AIS患者的PUMC分型。

SPRY4基因检测方法：(1)样本收集：采集空腹外周静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存备用。(2)基因组提取及测序：采用酚-氯仿抽提法提取全基因组DNA，并溶于TE缓冲液。基因组DNA经Nano Drop分光光度计测定纯度和浓度后，采用全基因组测序方法对SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点SNP进行分型检测，记录各位点等位基因频率、基因型、遗传模式等，所有测序工作均由深圳华大基因科技有限公司完成。

1.3 样本量估算

本研究为病例对照研究，以C等位基因频率作为主要观测指标进行样本量估算。检索国家生物技术信息中心数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term=)后发现，AIS患者rs10040443位点等位基因C的频率为8.4%，而健康人群仅为5%，在检验水准a=0.05，把握度为90%，样本比例为1∶1的情况下，经计算两组所需最低样本均为97例。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。等位基因频率、基因型、PUMC分型等计数资料以频数(百分数)表示，组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率法。采用卡方检验进行Hardy Weinberg遗传平衡检验。采用多因素Logistic回归法分析SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点SNP与AIS的关联性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

共入选符合纳入与排除标准的AIS 患者97例，健康受试者100名。健康受试者中，男性15例，女性85例；平均年龄(14.48±1.13)岁；SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点均符合Hardy Weinberg遗传平衡定律(P均>0.05)，提示各位点基因分布处于平衡状态，样本具有代表性。AIS 患者中，男性13例，女性84例；平均年龄(14.45±1.11)岁；rs10040443基因型频率分布偏离Hardy Weinberg遗传平衡定律，提示与疾病易感性存在关联。

2.2 SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型及等位基因分布与AIS的关联性

AIS患者rs10040443位点等位基因C及CC基因型频率均高于健康受试者(P均<0.05)，rs3797053位点等位基因频率及基因型分布与健康受试者均无显著差异(P均>0.05)，见表1。

表1 AIS患者与健康受试者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型及等位基因分布比较[n(%)]

进一步采用多因素Logistic回归分析校正性别因素后发现，在各种遗传模式下，rs3797053位点多态性与AIS均无明显关联性(表2)；在共显性、隐性及加性遗传模式下，rs10040443位点多态性与AIS存在关联性，其CC基因型可增加AIS发生风险(表3)。

表2 校正性别因素后，SPRY4基因rs3797053位点与AIS的关联性分析[n(%)]

表3 校正性别因素后，SPRY4基因rs10040443位点与AIS的关联性分析[n(%)]

2.3 AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型与性别及PUMC分型的关联性

AIS患者中，SPRY4基因rs3797053位点基因型分布与性别、PUMC分型均无明显关联性(P均>0.05)；rs10040443位点基因型分布与性别亦无明显相关(P>0.999)，但与PUMC分型具有一定关联性(P<0.001)，CT+TT基因型患者中PUMC Ⅱ型的比例显著高于CC基因型患者(66.67% 比0，P<0.001)，见表4。

表4 不同性别、PUMC分型AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型分布比较[n(%)]

3 讨论

本研究基于病例对照设计，首次探究了中国北方汉族人群SPRY4基因多态性与AIS的相关性，结果发现AIS患者SPRY4基因rs10040443位点等位基因C及CC基因型频率均较健康受试者升高；校正性别因素后，rs10040443位点在共显性、隐性及加性遗传模式下均与AIS具有关联性，该位点CC基因型与AIS发生风险增加有关。在SPRY4基因多态性与性别、AIS临床表型相关性的分析中发现，rs10040443位点基因型与PUMC分型亦存在一定关联性，提示SPRY4基因rs10040443位点可能参与了AIS发病，为该病的病因学研究提供了新思路。

SPRY可通过特异性抑制成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)受体、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体和血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)受体活性，在人类胚胎干细胞增殖与存活的调控中发挥重要作用。目前已知的SPRY家族由SPRY1、SPRY2、SPRY3及SPRY4组成[11-13]，其中SPRY1 和 SPRY2 编码蛋白是晶状体囊泡分离和角膜分化的必需物质，SPRY3参与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的负性调控[14]。SPRY4基因位于5q31.3，由5个外显子组成，其编码蛋白为受体转导的MAPK信号通路抑制剂，并可破坏活性单体GTP结合蛋白(GTP-rat sarcoma，GTP-RAS)的形成。研究显示，SPRY4 是人类胚胎干细胞中表达最高的两个Sprouty 家族成员之一[15-18]。在不同类型细胞中，SPRY4调控生长因子信号的应答效应存在差异[19]。Li等[20]研究发现，SPRY4在体内与体外对人脂肪源性间充质干细胞(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells，hAMSCs)的脂肪形成均有促进作用。与之不同，沉默C57BL/6小鼠骨髓中SPRY4表达可阻断脂肪堆积，该现象或可解释AIS患者体脂率普遍较低的原因[21]。由于肌肉和脂肪含量增加分别可将脊柱侧凸发生风险降低20%和13%[22]，而SPRY4蛋白可调控脂肪形成，故推测其与AIS具有一定相关性。此外，成骨细胞和软骨细胞分化功能障碍可能是AIS的促进因素，敲低健康人群软骨细胞中SPRY4基因可引起软骨细胞肥大、衰老、活性降低，并促进活性氧和细胞外基质表达，进而导致脊柱两侧软骨生长板生长速度不一致，诱发AIS[23]。

既往文献已证实，3′UTR区域可与miRNA相结合发挥骨骼生长发育调控作用。如Song等[24]研究发现，rs4148941位点(A等位基因)转录物与miR-513a-5p的相互作用可能与腰椎间盘退变具有一定关联性。FGF2的3′UTR区域中存在与中国人群骨矿物质密度相关的位点，且其功能受miR-196a-3p的调节[25]。检索文献未发现SPRY4基因多态性与AIS关联性的相关研究。本研究以rs3797053与rs10040443位点为切入点，首次在中国汉族人群中探究了SPRY4 基因多态性与AIS的关联性。此两个位点均位于3′UTR区域，且次要等位基因频率均大于5%。单因素分析显示，rs3797053位点等位基因频率及基因型分布在AIS患者与健康受试者之间无显著差异，AIS患者rs10040443位点等位基因C及CC基因型频率高于健康受试者，提示rs10040443位点可能与AIS发病具有相关性；校正混杂因素后此种相关性仍存在，认为rs10040443位点CC基因型可能增加AIS发生风险。

准确的AIS分型是制订临床治疗决策的前提和基础。AIS 主要包括三大分型系统，即King 分型、Lenke分型及PUMC分型，其中PUMC分型更适合指导AIS患者进行三维矫形[26]。本研究发现AIS患者SPRY4基因rs10040443位点CC+TT基因型与PUMC Ⅱ型具有一定关联性，CC+TT基因型的AIS患者更可能表现为PUMC Ⅱ型。由于AIS由多个基因调控且受多个环节、多种因素的影响，这可能从理论层面解释了AIS患者存在不同程度畸形的原因。

本研究局限性：(1)虽然初步认为SPRY4基因rs10040443位点多态性与AIS具有相关性，但目前尚缺乏足够的分子机制研究证据，二者是否具有因果关系尚需进一步验证。(2)AIS患儿在10～18岁期间，其脊柱畸形分型呈现为动态演变的状态，本研究PUMC分型仅为其中一个时间点的静态影像结果，以致研究结果可能存在偏倚。(3)本文研究对象均为中国北方汉族人群，结果外推需谨慎。

综上所述，SPRY4基因rs10040443位点多态性可能与中国北方地区汉族人群AIS具有相关性，该位点CC基因型可能为AIS的危险因素。此外，CT+TT基因型与PUMC Ⅱ型亦具有一定相关性，若AIS患者基因检测结果为CT+TT基因型，则其后期进展为PUMC Ⅱ型的风险增加，该基因位点有望成为预测AIS进展情况的参考指标，并辅助临床进行早期干预。本研究结果有助于明确SPRY4基因多态性与中国汉族人群 AIS 易感性的关系，为该病的病因学研究提供了新思路，并为临床干预提供了依据。

作者贡献：吴增玉负责研究设计、数据收集与整理、统计分析、论文撰写；张跃川负责文献检索；彭越负责伦理材料收集；吴南负责测序数据及伦理材料收集；邱贵兴、庄乾宇、仉建国负责研究设计、研究指导、论文修订。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突