Vaspin通过AMPK/mTOR自噬信号通路影响2型糖尿病大鼠胰岛β细胞功能

魏姣姣，刘师伟，段瑞雪，李 楠，王江娜

1山西医科大学第九临床医学院，太原 030009 2山西白求恩医院(山西医学科学院 同济山西医院)山西医科大学第三医院内分泌科，太原 030032 3华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科，武汉 430030 4山西医科大学研究生学院，太原 030001

糖尿病是最常见的代谢综合征之一，近年来其患病率呈逐年上升趋势，预计至2040年全球糖尿病患者人数将高达6.4亿，给社会带来极大的疾病负担[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是糖尿病的最主要形式，除胰岛素抵抗外，胰岛β细胞衰竭(包括胰岛β细胞数量减少和胰岛β细胞功能障碍)亦是其发病的主要原因[2]，其中胰岛β细胞功能障碍是T2DM发病的核心环节。因此，T2DM的理想治疗策略是在降低血糖的同时保护胰岛β细胞功能。

自噬是维持细胞稳态的一种保护性机制，在维持胰岛β细胞数量和功能方面起重要作用[3]。自噬受多种信号通路的调控，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是其中较为重要的通路之一[4]，对胰岛β细胞的功能维持尤其重要[5]。内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(visceral adipose tissue-derived serpin，Vaspin)是一种脂肪细胞因子[6]，具有调节胰岛素敏感性、糖耐量、减少食欲和抗动脉粥样硬化的作用[7-9]。研究发现，Vaspin可促进胰岛素分泌，改善胰岛β细胞功能[10]。在心肌细胞中，Vaspin可通过AMPK/mTOR通路激活自噬，改善缺血再灌注心肌细胞损伤[11]，但Vaspin能否通过AMPK/mTOR通路调节自噬，进而改善胰岛β细胞功能尚未明确。本研究以高脂高糖联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的方式制备T2DM大鼠模型，探究Vaspin改善T2DM大鼠胰岛β细胞功能的机制及具体信号通路，以期为T2DM的干预提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，体质量180～200 g，购自北京斯贝福动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(京)2019-0010。大鼠饲养于山西医科大学动物实验中心，室温22～26 ℃，相对湿度40%～60%，明暗周期12 h，保持通风换气，定期更换垫料。

本研究已通过山西医科大学实验动物伦理审查委员会审批(审批号：SYDL2022015)。

1.2 方法

1.2.1 试剂

主要试剂包括：重组人Vaspin蛋白(美国Phoenix公司)，STZ(美国Sigma公司)，血糖试纸(上海莱弗仕康医疗器材有限公司)，大鼠胰岛素酶联免疫吸附检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)，甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗鼠源性β-actin、AMPK、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)、mTOR、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)、LC3、P62、胰岛素抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，HRP-标记的山羊抗兔抗体、凝胶配制试剂盒、蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒及免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程公司)，ECL试剂盒(美国Affinity公司)。

1.2.2 造模、分组及干预

SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常对照组(n=10)和高糖高脂组(n=30)，分别给予标准饲料或高脂高糖饲料。饲养5周后，高脂高糖组大鼠腹腔注射STZ 35 mg/kg，3 d后取鼠尾静脉血检测，随机血糖>16.7 mmol/L视为T2DM造模成功[12]，造模不成功者剔除实验。取20只造模成功的大鼠，随机分为T2DM组(n=10)、Vaspin组(n=10)。Vaspin组每日腹腔注射Vaspin 960 ng/kg，连续干预8周[13]；T2DM组与正常对照组均腹腔注射等剂量生理盐水。

1.3 观察指标

记录造模前、干预前、干预4周和干预8周时3组大鼠体质量和空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)。干预8周时，进行如下测定：

1.3.1 代谢指标

取大鼠空腹静脉血，检测空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)、TC及TG。

1.3.2 糖耐量及胰岛素敏感性

(1)腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)：大鼠(n=6)禁食过夜后，腹腔注射20%葡萄糖2 g/kg，于注射0 min、30 min、60 min、90 min、120 min时取静脉血测定血糖变化，采用梯形法则计算血糖曲线下面积(area under the curve，AUC)，评估糖耐量变化。(2)腹腔胰岛素耐量试验(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)：于IPGTT 1周后进行。大鼠禁食过夜后，腹腔注射速效胰岛素2 U/kg，于注射0 min、30 min、60 min、90 min、120 min取静脉血测定血糖值，并计算AUC，评估大鼠胰岛素敏感性变化。

1.3.3 胰岛β细胞功能

采用高葡萄糖钳夹试验评估大鼠胰岛β细胞功能。大鼠(n=3)禁食过夜后(每组余4只大鼠中，因发生死亡或操作不当均剔除1只大鼠)，采用异氟烷吸入麻醉。麻醉成功后进行颈动脉、股静脉置管，静置30 min后于颈动脉插管的三通管处取血，测血糖水平；经股静脉插管处注入20%葡萄糖200 mg/kg(1 min内输注完毕)，微量泵持续输入20%葡萄糖(持续120 min)，每5 min检测1次血糖，根据血糖水平调整葡萄糖输注速率(glucose infusion rate，GIR)，使血糖水平维持在基础水平+7.9 mmol/L附近；血糖达稳态后，连续取3个时间点GIR均值作为稳态时的GIR。分别于输注葡萄糖0 min、5 min、10 min、60 min、90 min、120 min时，分别取颈动脉处血样200 μL检测血清胰岛素水平；第一时相胰岛素分泌量为0 min、5 min、10 min胰岛素水平之和，第二时相胰岛素分泌量为60 min、90 min、120 min胰岛素水平的均值。根据稳态时GIR及第一、二时相胰岛素分泌量，评估胰岛β细胞功能[14]。

1.3.4 组织病理学检查

高葡萄糖钳夹试验结束后处死大鼠，取胰尾组织，4%甲醛溶液固定；经逐级脱水、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色，光镜下观察大鼠胰腺组织形态。

1.3.5 胰岛素及自噬相关蛋白P62、LC3表达测定

采用免疫组化法测定3组胰腺组织胰岛素、P62、LC3表达水平。取石蜡包埋的胰腺组织切片，依次进行3～5 μm连续切片、脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复，山羊血清封闭30 min；滴加经PBS稀释(1∶200)的胰岛素、LC3及P62抗体，4 ℃孵育过夜；PBS清洗3次，滴加相应的二抗，37 ℃孵育30 min；切片依次经DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片，于显微镜下观察。采用IPP 6.0软件检测阳性组织平均光密度值(average optical density，AOD)，AOD越大表示蛋白表达量越高。

1.3.6 AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达测定

采用Western blot法测定各蛋白表达水平。首先按照试剂盒说明书中的操作步骤提取大鼠胰腺组织中的总蛋白，然后采用BCA法测定蛋白浓度并调整浓度为20 g/L；取蛋白样品，按体积比4∶1与5×蛋白上样缓冲液混合，100 ℃加热5 min使蛋白变性；通过SDS-PAGE电泳促进蛋白分离，采用湿转法将凝胶上的蛋白电转至PVDF膜，5% BSA或5%脱脂奶粉封闭1 h；加入AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、P62、微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein1 light chain3，LC3)Ⅰ、LC3 Ⅱ等特异性一抗(1∶1000)和HRP-标记的羊抗兔抗体(1∶5000)，经ECL发光显影，采用Image J软件分析各蛋白相对表达水平，并计算p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。体质量、FBG、FINS、TC、TG等符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vaspin对大鼠体质量及血糖水平的影响

3组大鼠造模前体质量、FBG均无统计学差异(P均>0.05)。与正常对照组比较，T2DM组与Vaspin组干预前、干预4周、干预8周时体质量均下降，FBG均升高(P均<0.05)；与T2DM组比较，Vaspin组干预4周时大鼠体质量及FBG无统计学差异(P均>0.05)，干预8周时大鼠体质量增高，FBG下降(P均<0.05)，提示Vaspin可降低T2DM大鼠血糖，提高体质量(表1)。

表1 3组大鼠不同时间点体质量、FBG比较

2.2 Vaspin对大鼠胰岛素及脂质的影响

与正常对照组比较，T2DM组、Vaspin组干预8周时FINS均降低，TC、TG均升高(P均<0.05)；与T2DM组比较，Vaspin组干预8周时FINS升高，TC、TG降低(P均<0.05)，提示Vaspin可改善T2DM大鼠脂质代谢，增加胰岛素分泌量(表2)。

表2 3组大鼠干预8周时FINS、TC、TG水平比较

图1 3组大鼠糖耐量及胰岛素敏感性比较(n=6)

2.3 Vaspin对大鼠糖耐量及胰岛素敏感性的影响

与正常对照组比较，T2DM组干预8周时的血糖AUC显著升高[IPGTT：(53.10±5.19)mmol/(L·h)比 (13.70±2.19)mmol/(L·h)，P<0.001；IPITT：(37.22±3.60)mmol/(L·h)比 (6.48±1.12)mmol/(L·h)，P<0.001]，Vaspin组大鼠血糖AUC虽高于正常对照组，但显著低于T2DM组[IPGTT：(42.76±4.81)mmol/(L·h)比(53.10±5.19)mmol/(L·h)，P=0.001；IPITT：(25.84±10.07)mmol/(L·h)比(37.22±3.60)mmol/(L·h)，P=0.006]，提示Vaspin可改善T2DM大鼠糖耐量及胰岛素敏感性(图1)。

2.4 Vaspin对大鼠胰岛β细胞功能的影响

高葡萄糖钳夹试验是评估胰岛β细胞功能的金标准，结果显示，与正常对照组比较，T2DM组大鼠稳态时GIR值[(7.23±1.47)mg/(kg·min)比 (25.92±1.61)mg/(kg·min)，P<0.001]、第一时相[(1.24±0.18)μg/L 比 (3.17±0.25)μg/L，P<0.001]及第二时相[(0.46±0.09)μg/L 比 (1.14±0.07)μg/L，P<0.001]胰岛素分泌量均降低；Vaspin组GIR值、第一时相及第二时相胰岛素分泌量虽亦低于正常对照组，但各指标均较T2DM组升高[GIR：(12.55±1.47)mg/(kg·min)比 (7.23±1.47)mg/(kg·min)，P=0.005；第一时相胰岛素分泌量：(2.31±0.20)μg/L比(1.24±0.18)μg/L，P=0.001；第二时相胰岛素分泌量：(0.72±0.04)μg/L比(0.46±0.09)μg/L，P=0.003]，表明Vaspin可改善T2DM大鼠胰岛β细胞功能(图2)。

2.5 Vaspin对大鼠胰腺组织病理学形态的影响

正常对照组大鼠胰腺组织中胰岛面积正常、形态结构完整、呈椭圆形，胰岛细胞排列均匀、整齐，形态规则，细胞核呈圆形且大致位于细胞中央，细胞质呈粉色，细胞核为深紫色。与正常对照组比较，T2DM组大鼠胰岛面积明显减少，胰岛结构明显被破坏，细胞分布不均匀、形状不规则，间质增多；与T2DM组比较，Vaspin组大鼠胰岛形态有不同程度改善，大部分胰岛细胞形态规则，细胞核形态恢复，提示Vaspin可明显减轻T2DM大鼠胰岛形态与结构损伤(图3)。

2.6 Vaspin对大鼠胰腺组织中胰岛素及自噬相关蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，与正常对照组比较，T2DM组大鼠胰腺组织中胰岛素表达水平降低(AOD：0.030±0.020比0.151±0.003，P=0.001)，P62(AOD：0.046±0.010比0.009±0.003，P=0.000)、LC3蛋白(AOD：0.073±0.017比0.035±0.022，P=0.028)水平升高；与T2DM组比较，Vaspin组大鼠胰腺组织中胰岛素(AOD：0.095±0.037比0.030±0.020，P=0.015)、LC3蛋白(AOD：0.172±0.005比 0.073±0.017，P=0.000)表达水平升高，P62蛋白表达水平降低(AOD：0.002±0.001比0.046±0.010，P=0.000)，表明Vaspin可激活自噬、改善自噬活性，进一步表明其可改善胰岛β细胞功能(图4)。

图2 3组大鼠高葡萄糖钳夹试验结果比较(n=3)

2.7 Vaspin激活大鼠胰腺组织中自噬的信号通路

Western blot结果显示，与正常对照组比较，T2DM组大鼠胰腺组织p-AMPK/AMPK比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及P62蛋白水平升高，p-mTOR/mTOR比值降低(P均<0.05)；与T2DM组比较，Vaspin组p-AMPK/AMPK比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白水平降低(P均<0.05)，提示Vaspin可通过AMPK/mTOR信号通路激活T2DM大鼠胰岛β细胞自噬(图5，表3)。

图3 3组大鼠胰腺组织病理图(HE，×400，n=3)

图4 3组大鼠胰腺组织胰岛素、P62、LC3蛋白表达免疫组化图(n=3)

图5 3组大鼠胰腺组织AMPK/mTOR信号通路活性及自噬相关蛋白表达凝胶电泳图(n=3)

表3 3组大鼠干预8周时p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62水平比较

3 讨论

胰岛β细胞功能衰竭是T2DM发生发展的重要病理机制[15]，改善胰岛β细胞功能障碍是该疾病防治的重要手段。Vaspin已被证实对胰岛β细胞具有保护作用，但其能否通过影响自噬发挥作用，以及调控自噬的信号通路尚未明确。本研究以T2DM大鼠模型为研究对象，探究Vaspin改善T2DM大鼠胰岛β细胞功能的具体作用机制。血液学检测结果显示，与T2DM组比较，Vaspin组干预8周时FINS升高，FBG、IPGTT与IPITT血糖AUC均降低，提示Vaspin可降低血糖，促进胰岛素分泌并增加胰岛素敏感性；对胰腺组织病理学与胰岛β细胞功能检查后发现，与T2DM组比较，Vaspin组胰岛β细胞损伤减轻，第一、二时相胰岛素分泌量均升高，进一步明确了Vaspin对胰岛β细胞具有保护作用；对大鼠胰腺组织中自噬蛋白及相关信号通路活性检测后发现，与T2DM组比较，Vaspin组大鼠胰腺组织中胰岛素表达水平、p-AMPK/AMPK比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高，p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白水平均降低，说明Vaspin干预后大鼠自噬能力增高，自噬相关通路AMPK/mTOR呈活化状态。结合以上结果初步判定，Vaspin可通过上调AMPK/mTOR信号通路活性，增强自噬，进而发挥保护胰岛β细胞、改善T2DM病情的药理作用。

3.1 Vaspin可改善代谢指标及胰岛β细胞功能

Vaspin属于脂肪因子，与多种代谢紊乱直接或间接相关。Kloting等[16]在不同糖耐量人群的研究中发现，血清Vaspin浓度增加与肥胖、胰岛素抵抗及T2DM代谢参数变化相关。Nicholson等[17]、Nakatsuka等[18]基于动物实验和T2DM人群研究发现，Vaspin可增加胰岛素敏感性、改善糖耐量、降低血糖，调节脂质代谢。本研究结果显示，经Vaspin干预后，T2DM大鼠体质量、FINS升高，TC、TG、FBG均下降，提示Vaspin具有改善T2DM大鼠脂质代谢紊乱、减轻胰岛素抵抗、增加糖耐量、降低血糖的作用，与既往报道结果一致。

除对代谢指标有调节作用外，有研究发现Vaspin作用于离体胰岛后，可引起葡萄糖刺激下的胰岛素分泌增加[10]，提示Vaspin亦可影响胰岛β细胞功能。本研究基于IPGTT与IPITT、高葡萄糖钳夹试验及组织病理学检查结果可知，相较于T2DM组，Vaspin组大鼠胰岛损伤明显减轻、胰岛β细胞功能明显增强、胰岛素敏感性明显增高，再次验证了Vaspin具有改善T2DM大鼠胰岛β细胞功能的作用。

3.2 Vaspin可增强胰岛β细胞自噬

自噬是细胞内的“清道夫”，可降解细胞内缺陷蛋白质、受损细胞器和有害物质，从而保护机体免受缺血、缺氧及部分外部刺激等造成的应激性损害[19-20]。在病理条件下，自噬能力不足或受损可能导致胰岛β细胞功能障碍甚至凋亡，诱发T2DM[3]。LC3、P62是公认的自噬标志蛋白，自噬形成时，胞浆型LC3(LC3 Ⅰ)的小片段多肽发生酶解后转变为膜型LC3(LC3 Ⅱ)，故LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬水平，其值越高表示自噬水平越高[21]；P62是一种泛素结合蛋白，其表达水平与细胞自噬活性呈负相关，自噬缺陷时出现P62累积[22]。最新基于T2DM人群和小鼠实验的研究结果表明，胰岛β细胞长时间暴露于游离脂肪酸中可引起自噬体积聚，伴随自噬蛋白LC3 Ⅱ和P62水平升高，提示暴露于脂肪酸的β细胞自噬水平呈代偿性激活但自噬活性下降，导致胰岛β细胞凋亡及其功能障碍，促进T2DM进展[20，23]。上调自噬水平或增加其活性，有助于维持胰岛β细胞活力及功能[3]，显著减少高浓度游离脂肪酸和葡萄糖引起的胰岛β细胞凋亡[24]，而Vaspin在其他细胞中已被证实具有激活自噬的作用[11]，理论上有可能通过调节自噬信号通路，改善胰岛β细胞功能。本研究发现，与正常对照组比较，T2DM组大鼠胰岛素水平降低，反映自噬水平的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及与自噬活性呈负相关的P62蛋白水平均升高，进一步验证了T2DM大鼠胰岛β细胞呈自噬水平升高但自噬活性降低的紊乱状态；与T2DM组比较，Vaspin组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62蛋白水平降低，提示Vaspin干预后T2DM大鼠胰岛β细胞自噬水平上调的同时自噬活性得到恢复，说明Vaspin改善胰岛β细胞的功能与调控自噬有关。

3.3 Vaspin调控AMPK/mTOR信号通路增强胰岛β细胞自噬

自噬受多个通路的调控，其中mTOR是负调控自噬的中心分子。mTOR通过参与多种生物过程以维持机体代谢平衡，包括调节细胞自噬、线粒体功能、脂肪生成、酮体合成及葡萄糖稳态[25]。AMPK是维持细胞内能量平衡、调控全身能量代谢的关键能量调节元件，其可抑制mTOR活性，启动自噬[26]，因此AMPK/mTOR信号通路不仅是细胞内能量代谢监测系统的重要位点，也是调节自噬的重要上游信号通路[27]。现有证据表明，罗格列酮和二甲双胍等糖尿病治疗药物改善T2DM患者胰岛β细胞功能的机制与通过AMPK/mTOR途径诱导细胞自噬增强有关[28]。既往文献证实Vaspin具有AMPK/mTOR调控作用，如Nakatsuka等[18]发现Vaspin可促进肥胖大鼠肝细胞AMPK磷酸化，改善葡萄糖、脂质代谢；Yang等[11]发现Vaspin可通过AMPK/mTOR通路激活自噬进而减轻缺血再灌注心肌细胞损伤。本研究对该通路关键调控蛋白检测后发现，与T2DM组比较，Vaspin组p-AMPK/AMPK比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高，p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白水平均降低，初步说明Vaspin可通过激活AMPK/mTOR 信号通路，增强胰岛β细胞自噬能力。

本研究创新性：首次阐明Vaspin改善胰岛β细胞功能的作用机制与细胞自噬有关。本研究局限性：(1)未设置AMPK/mTOR信号通路抑制剂组，Vaspin与该通路的详细作用关系尚未阐明；(2)仅为动物实验，确切结论需临床研究加以证实。

综上所述，Vaspin具有保护T2DM大鼠胰岛β细胞功能，促进胰岛素分泌并增加胰岛素敏感性的作用，以降低血糖、减轻T2DM病情，其作用机制可能与活化AMPK/mTOR信号通路，增强细胞自噬能力有关，该分子通路有望成为T2DM防治的新靶点。由于T2DM发病机制及自噬体系相当复杂，Vaspin调控自噬及其改善胰岛β细胞功能的机制仍需深入研究以进一步验证。

作者贡献：魏姣姣负责研究实施及论文撰写；刘师伟负责研究设计并指导论文修订；段瑞雪、李楠负责实验设计、数据分析及结果解读；王江娜负责实验过程及文献查询。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突