基于SPME-GC-MS技术快速鉴别不同产地的陈皮

陈明权， 商雪莹， 石洪超， 李华， 孙东， 覃仁安， 何风雷， 黄志敏

（1.广州白云山陈李济药厂有限公司，广东广州 510288；2.广东省药品检验所，广东广州 510663）

陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium）为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮[1]，其中来源于茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的果皮称为“广陈皮”，为道地药材，主产于两广地区，以广东新会产的广陈皮（即“新会陈皮”）品质最优[2]；而来源于橘及其除茶枝柑以外栽培变种的果皮称为“陈皮”。经市场调查发现，不同产地的陈皮之间的价格差可高达30 倍，一些不良商家以次充好，将“陈皮”冒充“广陈皮”、“非新会广陈皮”冒充“新会陈皮”进行售卖，从中牟取暴利，该乱象严重影响了陈皮行业的健康发展。因此，建立一种快速鉴别不同产地陈皮的方法以正本清源是十分必要的。

目前，关于陈皮产地的鉴别研究中有高效液相色谱（HPLC）指纹图谱[3]、红外光谱[4]、矿质元素[5]、基因组DNA[6]、代谢组学[7]、电子鼻[8]以及黄酮类化合物比值[9]等方法，但以上方法多存在检测过程较冗繁或需结合数据深度分析的化学计量法等问题，且只能区分“陈皮”与“广陈皮”，而无法区分“非新会广陈皮”与“新会陈皮”。相关研究[10-11]表明，中药材的次生代谢物的含量和各成分间的比例，会因栽培环境条件的变化而变化；黄璐琦等[12-13]也提出道地药材形成的逆境效应理论，以及合成和积累次生代谢产物是药用植物适应环境胁迫的策略[14-15]。鉴于此，本研究立足各产地陈皮的不同生长环境而产生的次生代谢产物各成分间的比例差异，采用固相微萃取（SPME）结合气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）技术，拟通过对比陈皮挥发油成分间的比值，快速区分不同产地的陈皮，为广陈皮的质量控制与鉴定提供参考，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器安捷伦HP-5 MS（30 mm × 0.25 mm ×0.25 μm）色谱柱（美国Agilent公司）；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）：50/30 μm PDMS/DVB 固相微萃取仪-纤维头（美国SUPELCO 公司，灰色）；20 mL SPME 专用采样瓶（美国SUPELCO 公司）；HWS-26 电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试验样品将陈皮样品分别编号为S1 ～S18，样品S1 ～S14 经广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定为芸香科植物茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的果皮，即广陈皮，其中包括产于广东新会地区的广陈皮（S1 ～S8，以下称为“新会陈皮”）以及除新会以外的其他地区的广陈皮（S9 ～S14，以下称为“非新会广陈皮”）；样品S15 ～S18 经鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及除茶枝柑以外的其他栽培变种的果皮，即“陈皮”，样品信息详见表1。为了保障本试验中陈皮样品来源的准确性及代表性，在所收集的18 个陈皮样品中有16 个（S1 ～S3、S6 ～S18）是从种植基地直接采集或购买的新鲜果实，然后剥皮、晒干制作而成的。

表1 不同产地陈皮样品信息表Table 1 Sample information sheet of Citri Reticulatae Pericarpium from different origins

2 方法与结果

2.1 供试品制备将陈皮样品剪碎边长约1 cm的小方块，取0.5 g于40 mL SPME专用采样瓶中，密封后于90 ℃水浴平衡10 min，插入固相萃取纤维50/30 μm CAR/DVB/PDMS 顶空萃取40 min，250 ℃解吸3 min进样。

2.2 色谱条件采用安捷伦HP-5 MS（30 mm ×0.25 mm × 0.25 μm）色谱柱，高纯He 作为载气，流速为1.0 mL/min，进样口温度为230 ℃。采用程序升温模式：柱初始温度为50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min的速率升至70 ℃，保持10 min；以8 ℃/min的速率升至110 ℃，保持5 min；以4 ℃/min的速率升至210 ℃，保持2 min。分流比为50∶1。

2.3 质谱条件离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，离子采集范围35 ～450m/z。陈皮样品GC/MS总离子流图，见图1。

图1 广东新会（S3）、广东乳源（S9）、广西防城港（S13）、江西赣州（S15）及湖南石门（S16）陈皮的GC/MS总离子流图（TIC）Figure 1 GC/MS total ion flow diagram（TIC）of Citri Reticulatae Pericarpium from Xinhui，Guangdong（S3），Ruyuan，Guangdong（S9），Fangchenggang，Guangxi（S13），Ganzhou，Jiangxi（S15）and Shimen，Hunan（S16）

2.4 方法学考察通过张靖年[16]、欧小群等[17]对广陈皮及其近缘品种挥发油成分的研究结果可知，不同品种来源的陈皮挥发油中均主含柠檬烯、γ-萜品烯等成分。因此，本研究以上述2个共有成分“柠檬烯/γ-萜品烯”的比值考察本试验方法学的适用性。

2.4.1 重复性试验 精密称取同一供试样品（S3）6 份，按“2.1”项下方法制备供试品并按“2.2”“2.3”项下条件进行检测，记录成分柠檬烯、γ-萜品烯相对百分含量及其比值（柠檬烯/γ-萜品烯），并计算比值的相对标准偏差（RSD）。结果显示，该比值的RSD为1.03%，表明方法重复性良好。

2.4.2 稳定性试验 取S3 供试品，分别在0、1、2、4、8、24 h按“2.1”项下方法制备供试品并按“2.2”“2.3”项下条件进行检测，记录成分柠檬烯、γ-萜品烯相对百分含量及其比值（柠檬烯/γ-萜品烯），并计算比值的相对标准偏差。结果显示，该比值的RSD为2.68%，表明供试品在24 h内稳定。

2.5 测定与结果采取“1.2”项下样品，每个样品平行制作2 份，按“2.1”项下方法制备供试品并按“2.2”“2.3”项下条件进行检测，所得质谱数据与NIST14 数据库进行匹配。同时，挖掘不同产地陈皮之间共有的挥发油成分，以共有成分为整体，计算样品中各共有成分的相对百分含量。结果见表2。

表2 不同产地陈皮共有挥发油成分相对百分含量（n=2）Table 2 Relative percentages of common volatile oil components of Citri Reticulatae Pericarpium from different origins（n=2）

由表2 可知，不同产地陈皮样品中之间共有10 个挥发油成分，它们分别是“α-蒎烯”“β-蒎烯”“β-月桂烯”“对伞花烃”“柠檬烯”“γ-萜品烯”“萜品油烯”“麝香草酚”“石竹烯”“α-法呢烯”。然后，将上述10 个成分的相对百分含量，一个作为分子，另一个作为分母进行两两排列组合，由此可得到45 组比值。结合表1 中的样品信息，分析上述45 组比值数据是否能区分新会陈皮、非新会广陈皮、陈皮。经数据分析发现，能区分不同产地陈皮的比值有4组。详见表3。

表3 可用于产地区分的挥发油成分比值（n=2）Table 3 Ratio of volatile oil components that can be used for origin differentiation（n=2）

从表3 中可以得知，通过比值“α-蒎烯/β-蒎烯”“α-蒎烯/β-月桂烯”“β-蒎烯/β-月桂烯”“β-蒎烯/柠檬烯”均能区分广陈皮与陈皮，其中，能区分新会陈皮与非新会广陈皮的，只有比值“α-蒎烯/β-蒎烯”；其区分临界点为：当比值“α-蒎烯/ β-蒎烯”≤1.350 时，则为新会陈皮；当比值1.350＜“α-蒎烯/β-蒎烯”≤1.70 时，则为非新会广陈皮；当比值“α-蒎烯/β-蒎烯”＞1.70 时，则为陈皮。

以上结果表明，通过挥发油成分比值“α-蒎烯/β-蒎烯”可将不同产地陈皮进行精准区分。

3 讨论

关于陈皮样品粒度的优选，本研究考察了边长约1 cm 的小方块、24 目粉末及50 目粉末等3 个因素，以及0、1、4、24 h不同放置时间对陈皮挥发油成分的影响。结果表明，不同粒度的陈皮样品，放置时间越长，挥发油成分含量均整体呈现逐渐下降的趋势，下降程度大小依次为50 目粉末＞24 目粉末＞边长约1 cm 的小方块，其中边长约1 cm 的小方块的陈皮样品中挥发油成分没有发生显著性变化，表明放置时间不同对其影响较小。因此，本研究选择的最佳样品粒度为边长约1 cm 的小方块，而关于萃取温度等条件的最优选择，则基本按照丘芷柔等[18]的固相微萃取优化试验结果。

在挥发油成分提取方法方面，本研究采用SPME技术提取陈皮样品中挥发油成分，相较于传统的加热回流法，本法既能克服回流法因提取温度过高而破坏陈皮中挥发油成分之间的组分构成的缺陷，又能大大缩短挥发油成分的提取时间（只需40 min）。在陈皮样品处理方面，本研究将陈皮剪碎呈边长约1 cm 的小方块作为供试品，较粉碎后过筛的方法，本法不仅能避免粉碎过程因粉碎机产热而造成部分挥发油成分的挥发损失，以及样品因放置时间长以致挥发油成分的大量走失，而且能使挥发油成分被充分提取。

本研究通过SPME-GC-MS 技术建立的不同产地陈皮快速鉴别方法，不仅可以精准区分新会陈皮与非新会广陈皮，而且方法准确可靠、重现性好。同时，结合不同产地陈皮样品信息可知，该鉴别方法不受成熟度、年份等因素的影响，表明该法是可行的。由于本次研究的样品数量有限，有待于收集更多不同来源的样品，进一步验证该鉴别方法的可行性。