生物酶在烟草工业中的应用研究进展

黄申,芦尧,刘强,赵声辰,陈芝飞,毛多斌

1.郑州轻工业大学 烟草科学与工程学院,河南 郑州 450001;2.河南中烟工业有限责任公司 技术中心,河南 郑州 450002

0 引言

生物酶因其催化条件温和、催化效率和生物安全性高、作用效果显著等特点,已被广泛应用于医药生产[1]、食品加工[2]等行业[3]。

烟叶中普遍存在蛋白质、淀粉、果胶、纤维素等生物大分子,其含量过高会在卷烟燃吸过程中产生刺激性气味及多种有害成分,从而对烟草制品的感官品质产生不良影响[4],而蛋白酶[5]、淀粉酶[6]、果胶酶[7]、纤维素酶[8]等可将对应底物催化水解生成香味物质或其前体物,因此相应的催化水解机制已成为烟草工业的研究热点之一。西柏烯类[9]、类胡萝卜素类[10]、糖苷类[11]等是烟草重要的香味前体物,其催化转化过程也可由特定酶来完成。已有研究[12]表明,生物酶也可用于烟用香料的开发。生物酶的特点和功能决定其可在一定程度上改变烟草的化学组成,进而改善卷烟的感官品质。

合理利用生物酶处理烟叶及烟草制品能够增加卷烟香气、减少杂气和刺激性、降低危害,达到改善卷烟感官品质的目的[13]。因此,烟草生物酶的创制、应用和催化功能研究具有重要意义。本文拟对烟草工业中生物酶的应用研究进行综述,分析生物酶在烟草领域应用中存在的问题,展望本领域技术发展,旨在为烟用酶制剂创制、功能开发及应用提供参考。

1 生物酶在烟叶处理中的应用

近年来,生物酶主要被用来处理烟叶以降解蛋白质、果胶、淀粉等生物大分子、降低烟叶杂气和刺激性、提升烟叶品质等,其种类分为单酶制剂、混合酶制剂及粗酶制剂。处理对象包括新鲜烟叶、单料烟、模块烟等,处理阶段包括烟叶初烤前、烟叶陈化后、在线制丝等环节。

将生物酶喷在初烤前新鲜成熟烟叶上,初烤过程中在烤房适合的温湿度条件下,生物酶发挥催化作用,起到调节烟草化学组分,改善烟叶品质的作用。樊文举等[14-15]将果胶酶喷在新鲜成熟烟叶(NC99中部叶)上,晾干初烤后,发现烟叶中常规化学成分更协调、烟叶香气总量及热失重率增加,烟叶整体品质明显提升。雷亚芳[16]将α-淀粉酶和纤维素酶混合而成的复合酶喷施在新鲜成熟的陕南K326上部烟叶上,晾干初烤后,发现烟叶淀粉含量和总糖含量降低、还原糖含量增加,且香气浓度增加、香气质量得到改善、杂气和刺激性减少。王林等[11]将混合酶(中性蛋白质酶、α-淀粉酶和糖化酶)喷在新鲜烟叶(中烟100上部叶)上,晾干初烤后,发现烟叶中可溶性糖含量及游离态和糖苷结合态中性香气成分含量提高,烟叶品质得到改善。S.S.Lin等[17]使用蛋白水解酶和木聚糖水解酶处理新鲜烟叶,初烤后,发现烟叶和卷烟烟气中的烟碱分别降低了11.55%和21.85%。

生物酶亦可用于催化处理陈化后烤烟烟丝,处理数小时后,烟丝中生物大分子含量明显降低,烟丝感官品质得以提高。朱晓兰等[18]使用果胶甲酯酶、果胶裂解酶、半乳糖醛酸酶、纤维素复合酶分别处理烤烟烟丝(云南烟叶C3F)5 h后可有效降低烟叶中果胶含量,其中经果胶裂解酶和纤维素酶处理后的烟叶中性香味成分分别提高了24.4%和21.9%。之后,该团队利用纤维素酶处理烤烟烟丝,发现烟丝中纤维素的降解率最高可达13.5%,苯丙氨酸降解产物、美拉德反应产物、类胡萝卜素降解产物和新植二烯等中性香味成分的含量均显著增加,中性香味物质总含量提升了50 μg/g[19]。沙云菲等[20]利用复合酶制剂(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶)处理烟丝B2F(pH值为7.7、含水量54%),酶解时间5.5 h,淀粉和蛋白质降解率分别达到19.54%和20.03%,酶处理后,烟叶的杂气、劲头和刺激性得到明显改善。郑娟娟[21]利用α-淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合成的复合酶制剂酶解烟丝(宝鸡X3F和商洛B3F),酶解条件为温度50 ℃、时间4 h,发现烟丝还原糖含量增加,挥发性香气成分含量大幅提升,烟气细腻柔和、甜感增加。罗丹等[22]使用α-淀粉酶和糖化酶在55 ℃条件下处理烟丝(云烟85 C3F,产地凉山)8 h,发现烟丝中直链淀粉和支链淀粉分别减少了34.5%和66.7%;但酶处理后烟叶组织结构由于淀粉降解而出现塌陷,呈现大面积的凹凸不平区域。李洪涛等[23]利用蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶、酸性木聚糖酶、脂氧合酶、纤维素酶混合成的复合酶制剂处理复烤山东TBO片烟(2009)7 d,发现处理后烟叶枯焦气降低,烟香增加,余味得到改善。

也有研究人员利用筛选得到的可降解生物大分子微生物表达的酶处理烟叶,如王宝强等[24]在筛选产淀粉酶微生物的基础上制备了淀粉酶,用该酶处理K326 B4F烟叶48 h,发现烟叶感官品质得到改善。贺兆伟等[25]用疣孢青霉菌株TS63-9所产粗酶液处理烟丝(红花大金元C3F),处理条件为40 ℃、8 h,发现其可显著降低烟丝中果胶含量,烟叶感官品质也得到一定程度改善。

此外,有研究[26]将复合生物酶应用于在线制丝环节(酶解条件为50～60 ℃、4～6 h),发现处理后膨胀烟丝的木质气、枯焦气明显减轻,淀粉、蛋白质和烟碱含量降低,膨胀烟丝的感官品质和配伍性显著提升,该研究为生物酶的在线应用提供了例证。

由以上研究可知,近年来关于淀粉、果胶酶催化降解方面的相关研究取得了较大进展,复合酶的作用效果多优于单一酶,并且在烟草生物大分子降解的同时常常伴随着烟叶感官品质的提高,以及烟叶杂气和刺激性的降低。但烟用生物酶创制、生物酶催化转化机制、适应卷烟生产条件酶制剂开发等相关研究鲜有报道,亟待深入研究。

2 生物酶在烟梗处理中的应用

由烟梗制作的梗丝是卷烟配方的主要原料之一,具有提高燃烧性和降低烟碱、焦油的作用,但梗丝中的木质素、纤维素、半纤维素、果胶等生物大分子在燃烧过程中会产生木质气和刺激性,影响卷烟的感官品质。生物酶处理烟梗还可以降低其中的木质素和纤维素的含量。

近年来,烟梗中木质素的降解多采用漆酶、氧化物酶和仿酶,高温(45～55 ℃)条件下处理数小时,可明显降低木质素的含量。杨云[27]使用不同产地漆酶处理烟梗丝,发现白腐菌产的漆酶DENYKEM PAP-5对烟梗中木质素降解效果最好,降解率可达15.92%,且处理后的烟梗感官品质明显提升。于建军等[28]研究发现,漆酶降解梗丝木质素的条件为温度45 ℃、漆酶用量20.0 U/g,处理梗丝3 h后木质素理论降解率为55.05%,且酶解后的梗丝表面更加光滑、毛突减少,香气量提高、香气质和余味得到改善。魏登辉[29]利用Fe-CA仿酶和漆酶分别处理梗丝发现梗丝中木质素降解率分别达到53.03%和55.05%,香气质和香气量得以提升、木质气减少、刺激性降低。但也有研究[30]表明,使用生物酶处理烟梗浆料后,梗丝的物理结构会遭到破坏。

宋自力等[31-32]使用白腐菌产漆酶发酵培养基筛选出多株漆酶高产菌,使用筛选出的血红密孔菌发酵粗酶液和菌丝对烟梗进行生物降解,发现漆酶可以有效降解烟梗中的木质素、纤维素、半纤维素和果胶,且使用漆酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成的复合酶处理烟梗可达到同样效果,该方法可大幅降低漆酶用量,减少工业成本。姜林峰[5]将漆酶和中性蛋白酶混合后酶解烟梗,发现酶处理既降低了烟梗中木质素含量又抑制了其中蛋白质含量的增加。Y.Zhu等[33]研究表明,漆酶降解烟梗木质素的机制可能是它可以破坏烟梗木质素酚型苯环间的β-O-4连接键,从而加速木质素的氧化解聚。

此外,亦有利用糖苷酶(纤维素酶、果胶酶等)处理烟梗以降低其纤维素、半纤维素和果胶含量的报道。赵梦醒等[34]用纤维素酶和半纤维素酶处理烟梗浸提液可明显改善烟梗打浆性能。徐达等[35]使用复合酶制剂(复合植物水解酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶)酶解梗丝4 h后,其水溶性总糖和美拉德反应产物含量分别提高了23.31%和196.3%,果胶含量降低了17.26%,将处理后的梗丝按照质量分数15%的掺配比例添加到金圣卷烟叶组中,叶组焦油含量降低了0.25 mg/支。杨乾栩等[36]利用酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶组成的复合酶处理烟梗24 h后,烟梗中的大分子物质总水解率达28.34%,烟梗刺激性降低,杂气得以改善,余味也有所提升,其感官品质和工业可用性得到提高。邹芳等[37]使用筛选出的枯草芽孢杆菌YC-2降解烟草秸秆(与梗丝成分接近)7 d后,发现烟秆降解率为10.14%,酶学特性表明该酶稳定性较好,有较强的应用潜力。Y.Y.Han等[38]利用果胶酶对预爆和搓丝处理的烟梗进行酶解后发现,半乳糖醛酸的含量明显提高,但烟梗的化学结构没有明显变化。

综上所述,单独使用漆酶可有效降低烟梗中木质素含量,但同时会增加蛋白质含量,增大梗丝的刺激性、杂气,且在一定程度上破坏梗丝的物理结构,影响其可用性,因此漆酶与蛋白酶搭配使用效果更佳。其他水解酶的复合物可一定程度降解烟梗中的大分子物质、增加可溶性糖含量,进而降低梗丝的杂气和刺激性。此外,对烟梗进行酸处理、碱处理、汽爆处理等预处理后再进行酶解处理,可显著提高酶解效果。

3 生物酶在烟草薄片生产中的应用

再造烟叶浓缩液是烟草及其制品的水提浓缩物,其中含有大量的烟草生物大分子物质,但香味物质含量较少,在用其制备造纸法生产烟草薄片时会影响烟草薄片的品质[39]。在烟草薄片工业生产中,可以应用生物酶对再造烟叶浓缩液中的生物大分子香味前体物等进行催化转化,以提升其品质和可用性。

马科等[40]利用中性蛋白酶处理再造烟叶浓缩液,发现浓缩液中蛋白质、还原糖、总糖和氨基酸质量分数均大幅降低,新增4-环戊烯-1,3-二酮、β-紫罗兰酮等10种香味物质,烟草薄片的香气、谐调性、刺激性、余味等均得到改善。许春平等[41-42]利用由微紫青霉(Penicilliumjanthinellumsw09)产生的果胶酶分别处理再造烟叶原料烟梗末与烟梗,在最优处理条件下烟梗末及烟梗中果胶降解率分别达到38.92%和41.35%,对酶解后烟梗的热裂解产物进行分析,发现苯乙酮含量增加、乙酸含量减少、香味物质吡咯含量升高。C.Chen 等[43]为提高再造烟叶片的品质,采用弱碱强化漆酶水解的方法去除烟梗中的木质素,发现漆酶、弱碱和吐温80协同作用能显著提高木质素降解率(高达40.3%)。徐菲菲等[44]依次使用蛋白酶和果胶酶处理再造烟叶浓缩液4 h后,香气成分总量增加了22%,刺激性降低的同时烟气品质得到了提升。赵梦醒等[30,34]利用纤维素酶和半纤维素酶预处理烟梗5 h,其浆料中纤维素的相对含量增加,而烟碱类物质相对含量减少,烟梗浆料的热稳定性得以提高。王茜茜等[45]将混合酶(纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶等)应用于梗二级提取段过程,可有效减少再造烟叶浓缩液中大分子物质含量,提高再造烟叶内在品质及使用价值,但该酶制剂组成复杂,成本较高。刘恩芬等[46]利用混合酶(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶及纤维素酶)对烟梗膏稀释液进行酶解转化处理,可在一定程度上控制烟梗提取液中大分子物质的含量,为生产过程中烟梗提取液的品质提升奠定一定的理论依据。

综上所述可知,因为再造烟叶浓缩液为有水环境,相较于烟叶、烟梗和烟丝,生物酶处理再造烟叶浓缩液具有处理时间短、效率高、作用效果显著等优点,是生物酶应用于烟草工业的重要应用窗口。

4 生物酶在生物产香中的应用

近年来,利用酶进行生物产香的研究逐渐成为烟草行业的热点之一,且多数集中在利用水解酶和氧化还原酶处理烟草提取物,以产生新的香味成分,并将其制备成烟用香料。

刘彩红[47]采用淀粉酶和β-淀粉酶水解烟草废弃物7 h,将酶解液与L-丙氨酸进行美拉德反应,反应物中检测出与烟草相关的香味成分57种,两种酶对卷烟香气有较好的修饰作用。许春平等[48]利用纤维素酶与木瓜蛋白酶处理烟末水提物并进行美拉德反应,反应物检测出与烟草相关的香味成分38种,且反应物能降低卷烟烟气的刺激性,谐调香味。刘珊等[49]利用黄嘌呤氧化酶催化氧化降解β-胡萝卜素,生成了烟草及烟草制品中的重要香气物质(如异佛尔酮、β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮及二氢猕猴桃内酯等)。白家峰等[12]用酶降解烟草花蕾,然后进行美拉德反应,产物中软脂酸、肉豆蔻酸、苯甲醇、苯乙醛、三环烯等物质含量较高,二氢猕猴桃内酯、大马士酮、油酸酰胺、2-正戊基呋喃等致香物质含量提高,对烟草香气贡献突出,但作者并未交代酶的种类和来源。

由以上研究可知,目前烟草行业利用酶进行生物产香主要有3种途径:一是利用水解酶降解烟草生物大分子物质(包括蛋白质和多糖类成分),所产生的氨基酸和糖进行美拉德反应生成香气物质;二是利用糖苷水解酶催化转化烟草香味前体物生成香气物质;三是利用氧化还原酶直接催化香味前体物产香,但是该方向尚缺乏系统性研究,产香机制也尚未完全阐明。

5 生物酶在烟草工业中其他方面的应用

目前,亦有利用生物酶降解烟草有害成分及利用烟草资源生产高附加值酶等方面的报道。刘兴余等[50]将生物酶用于卷烟和再造烟叶生产过程,酶解后烟叶中NNK(4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮)释放量选择性降低了23.2%,且酶解烟叶所制卷烟的感官评价结果与对照组无明显差异。L.Z.Liu等[51]将过氧化氢酶固定在聚丙烯酰胺壳中制备的纳米胶囊能有效清除烟草烟雾中90%的自由基。C.W.Dong等[52]利用来自假单胞菌的烟碱羟化酶催化6-羟基-3-琥珀酰吡啶转化成2,5-二羟基吡啶,后者是抗癌药物5-氨基乙酰丙酸的前体物。Y.X.Zheng 等[53]使用固定化米根霉发酵烟草工业废水以生产内、外切聚半乳糖醛酸酶(可水解木质纤维素果胶),实现果胶降解酶的高效生产。G.Zhang等[54]从雪茄茄衣中分离出龙舌兰杆菌,该菌可表达碱性果胶酶,果胶酶活性最高可达1370 U/mL。

从以上研究可知,生物酶在烟草工业中的应用还包括:利用生物酶催化转化烟草有害物以降低其含量,催化转化尼古丁以获得药物前体物,以及从烟草源微生物中挖掘重要功能基因等。

6 结论与展望

目前,生物酶在烟草工业中的研究多集中于利用生物酶处理烟草及烟草制品,以降低烟草中生物大分子物质含量和有害物含量,以及增加香味物质含量等方面,而关于烟草生物大分子物质结构、酶制剂的创制及酶催化转化机制的阐明等方面研究较少。因此,对于生物酶在烟草工业中的应用,今后的研究主要应从以下几个方面进行。

1)在烟草加工过程中,烟叶生物大分子物质会发生结构和形态的变化,从而导致研究者无法选择最合适的生物酶。所以,表征调制及醇化过程中烟草生物大分子物质的结构特征和存在形式,建立烟草中生物大分子物质的检测方法,对于生物酶的筛选、烟用生物酶的创制、生物酶特异性和效率提高等具有重要意义。

2)基于酶的结构特异性,开发具有自主知识产权的特异性催化烟草生物大分子物质的新型生物酶,提高酶的底物特异性,降低成本,加快产业化应用。

3)卷烟的加工环境具有高温、低水分、高渗透压及高烟碱等特点,这种环境抑制了现有生物酶的催化效率。针对该问题,可对现有生物酶进行基因工程改造使其适应卷烟环境,进而拓宽其使用范围,提高其催化效率。