不同光照处理对银柴胡愈伤组织形成及褐化的影响

王煜纬， 代晓华

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

银柴胡（Stellaria dichotomaL. var. Lanceolata Bge），石竹科（Caryophyllaceae）繁缕属（Stellaria）多年生草本植物，别名为银胡、山菜根、牛肚根、山马踏菜根、土参、沙参、披针叶叉繁缕、披针叶繁缕等。银柴胡干燥的根部可入药，是一种应用广泛的大宗药材。其主产地在宁夏、陕西、甘肃、内蒙古等地，宁夏是其道地产区[1—2]。银柴胡具有清虚热、除疳热、抗炎症、抗癌症、抗过敏等药效，在临床上可用于阴虚发热、小儿疳热、骨蒸劳热等症状[3]。目前宁夏地区野生银柴胡资源由于过度采挖已严重匮乏，不能满足其药用植物需求[4]。宁夏银柴胡人工种植面积为全国最大[5]，然而人工栽培面临育苗周期长、繁殖系数低、种子混杂等问题，使得银柴胡大面积推广和产出受到限制。此外，市场调查发现多种银柴胡混淆品冒充银柴胡药材在市场流通使用[6]。银柴胡人工栽培须实现新的突破以应对市场需求。

传统药用植物繁殖借助植物组织培养技术使育苗周期缩短，繁殖系数增加，解决了部分药用植物有性繁殖系数及成活率较低的问题。植物组织培养技术为药用植物种苗标准化规模化生产提供了技术保障，为有效缓解种质资源供需矛盾、保护物种多样性提供了技术支持[7—9]。现阶段，银柴胡组织培养方面的研究相对较少，本试验通过不同光照处理，研究暗处理时间与光照强度对银柴胡愈伤组织形成及褐化的影响，以期为银柴胡高效快繁体系提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为宁夏大学农学院农科综合实训基地大棚当年生银柴胡实生苗腋芽。

1.2 试验药品及仪器

药品：无水乙醇、无菌水、氢氧化钠、氯化汞、MS培养基、蔗糖、琼脂、6-BA，NAA。

仪器：超净工作台、酒精灯、镊子、接种剪、培养皿、滤纸、锥形瓶、烧杯、纱布、培养瓶、高压灭菌锅、电子天平、不锈钢锅、电磁炉、pH 试纸、枪型接种灭菌器、移液器、容量瓶。

1.3 测定指标

出愈率（%）=愈伤组织数量/未污染接种数量×100；成活褐化率（%）=褐化数量/总成活数量×100。

1.4 数据统计

利用Excel 2010、Origin 2021 整理数据及作图，利用SPSS 26 进行数据统计分析，采用最小显著差数法（LSD）对相关性指标进行方差分析和显著性检测（α=0.05）。

2 试验与设计

2.1 试验设计

试验为两因素完全随机设计，设置3 个暗处理时间和3 个光照强度（表1），共计9 个处理。每种处理接种2 瓶，每瓶5 个，设3 次重复，35 d 后进行观测。

表1 暗处理时间与光照强度

2.2 试验方法

外植体消毒：将新鲜材料放入烧杯中，用纱布包住杯口放在自来水下冲洗30 min 后转移到超净工作台。先用φ（酒精）=75%浸泡30 s，用无菌水冲洗3 次，每次不少于15 s；用φ（氯化汞）=0.1%冲洗60 s，再用无菌水冲洗5 次，每次不少于30 s；最后用无菌滤纸吸干水分。将腋芽剪为0.5～1.0 cm 小段，处理好后待接种。

培养基熬制：称取适量MS 培养基（ρ=4.74 g/L）、琼脂（ρ=7 g/L）、蔗糖（ρ=30 g/L），放入锅中熬煮至澄清透明，倒入量杯调节pH 至5.5～6.0，加入NAA（ρ=4 mg/L）与6-BA（ρ=1 mg/L），均分到培养瓶中，每瓶50 mL，迅速放入高压灭菌锅内消煮，将灭菌好的培养基移至超净工作台待接种。

将处理好的腋芽接种于MS+NAA+6-BA 培养基，将培养瓶移至培养室中。不进行暗处理直接放置在8 000、10 000、16 700 lx 光照强度下；暗处理7 d 后放置在8 000、10 000、16 700 lx 光照强度下；暗处理14 d 后放置在8 000、10 000、16 700 lx 光照强度下。培养室条件：温度25 ℃，湿度15%～30%，光照时间12 h/d。

3 结果与分析

暗处理时间与光照强度对腋芽诱导愈伤组织及愈伤组织褐化的影响见表2。

表2 不同暗处理时间与光照强度对腋芽愈伤组织诱导及褐化的影响

方差分析表明，不同暗处理时间对愈伤组织诱导的影响极显著，光照强度对愈伤组织诱导的影响不显著。3 个时间的暗处理出愈率差异显著，其出愈率大小依次为14 d、7 d、0 d。可见暗处理时间最佳为14 d，出愈率74.4%，14 d 处理比7 d 处理高6.6%，比不进行暗处理高13.3%。3 个光照强度处理无显著性差异，光强10 000 lx 下出愈率较高（71.1%）。暗处理时间与光照强度无交互作用，两因素中愈伤组织出愈率只受到暗处理时间的影响。最佳腋芽诱导愈伤组织光照处理为暗处理14 d。

暗处理时间及光照强度对愈伤组织褐化的影响极显著，暗处理时间与光照强度两者无交互作用。3个暗处理时间对褐化率的影响差异显著，其褐化率由小到大依次为14 d、7 d、0 d，愈伤组织褐化率随暗处理时间增加呈降低趋势。暗处理14 d 比7 d 低5.6%，比不进行暗处理低14.5%。不同光照强度处理之间差异显著，其褐化率由小到大依次为8 000、10 000、16 700 lx，光照强度8 000、10 000 lx 之间无显著差异，8 000、10 000 lx 比16 700 lx 褐化率低10%，愈伤组织褐化率较低的光照强度处理为8 000 lx、10 000 lx。褐化率最低的光照处理为暗处理14 d，光照强度为8 000 或10 000 lx。

4 讨论与结论

4.1 讨论

本次试验发现影响愈伤组织产生的因素为暗处理时间，而影响愈伤组织褐化的主要因素为暗处理时间和光照强度。随着暗处理时间增加，银柴胡出愈率呈升高趋势，褐化率随着暗处理时间增加呈减小趋势，暗处理14 d 的愈伤组织褐化率最低。许忠民等[10]在研究甘蓝花药愈伤组织诱导时发现，暗处理3 d 有利于愈伤组织产生。田萍[11]对灯盏蜜橘愈伤组织的诱导试验表明，进行暗处理相较于直接开始光照更有利于愈伤组织诱导。李兴桃等[12]对瞿麦诱导愈伤组织的试验表明，先暗培养25 d 再进行光照，比直接在光照条件下培养外植体能更快诱导愈伤组织，且愈伤组织生长更好。周晓鹿[13]研究发现，预先暗处理外植体可以显著降低愈伤组织褐化。杨晓光[14]对胡桃楸的组培试验表明，15 d 左右暗处理有利于愈伤组织产生。周春娥等[15]在怀地黄花药愈伤组织诱导试验中发现，黑暗条件有利于愈伤组织培养，且减少了后期生长中的褐化现象。吴晓玲等[16]对银柴胡愈伤组织诱导的试验表明，暗处理可显著降低愈伤组织褐化。综上所述，植物组培在诱导愈伤组织阶段可以适当暗处理，这有利于愈伤组织诱导，还可以抑制后期褐化，这与本试验结果相符，而增加光照强度会提高相关酶活性，促进植物组织培养中多种酚类物质氧化，导致褐化程度加强[17]。这与酚类物质的合成和氧化相关的酶是光诱导型有关[18]，而酚类物质氧化为醌类物质是导致褐化最直接的原因之一[19]。本试验中光照强度为16 700 lx 时愈伤组织褐化率显著增加，说明更高的光照强度加速了酚类物质的合成和氧化，从而使褐化率显著升高。

4.2 结论

暗处理时间对银柴胡腋芽出愈率有极显著影响，光照强度对腋芽出愈率影响不显著，且两者之间无交互作用，只有暗处理时间对腋芽愈伤组织形成有影响，出愈率与暗处理时间呈正相关，14 d暗处理的腋芽出愈率最高。暗处理时间和光照强度均对愈伤组织褐化率有极显著影响，两因素之间并无交互作用。暗处理14 d，愈伤组织褐化率最低；光照强度8 000 或10 000 lx，愈伤组织褐化率最低。在无两因素交互作用的影响下，愈伤组织褐化率最低的暗处理时间为14 d，光照强度为8 000 或10 000 lx。