妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇血清PDCD4，GLUT1表达水平及其与妊娠结局的相关性研究

罗亚丽，黄志刚，罗思通，徐 洲 （.巴中市巴州区妇幼保健院妇产科，四川巴中 66000；.四川大学华西医院实验医学科，成都 6004；.四川锦欣妇女儿童医院妇产科，成都 60066）

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是妊娠中晚期一种常见的并发症，其主要表现有肝功能异常、黄疸以及皮肤瘙痒等症状[1-2]。ICP 病因较为复杂，其发病机制目前尚不十分明确，可能与雌激素水平、遗传以及环境等因素有关[3]。有研究发现，ICP 对孕妇和胎儿预后影响较大，可导致母体并发症增多及胎儿宫内窘迫、胎儿早产以及新生儿窒息等妊娠结局不良[4]。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是一类与细胞凋亡有关的新基因，广泛表达于多种器官和组织。研究表明[5-7]PDCD4 参与多种肿瘤疾病的发生和发展，可调控血管内皮细胞的侵袭与凋亡。葡萄糖转运蛋白（glucose transporter，GLUT）是调节体内葡萄糖转运以及胰岛素的分子，已有研究证实GLUT 在胎盘组织中的异常表达与妊娠期疾病密切相关[8]。目前关于PDCD4 与GLUT 在ICP 中的研究鲜有报道，因此本研究旨在探讨孕妇血清PDCD4 与GLUT 在ICP中的表达以及二者与妊娠结局的相关性，以期为ICP 的临床诊治提供生物检测指标。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年7月～2020年7月收治并在巴州区妇幼保健院产科分娩的ICP 孕妇126例作为研究组，年龄22～37(26.99±2.54)岁；孕周≤34 周为62 例，＞34 周为64 例；平均体质量指数（BMI）26.17±1.56 kg/m2；孕次1～4(2.41±0.25)次。纳入标准：①符合2015 版《妊娠期肝内胆汁淤积症诊疗指南》[9]；②孕妇首次确诊为ICP；③临床上为轻度皮肤瘙痒；④患者均为初次妊娠；⑤资料完整。排除标准：①有严重妊娠期并发症者；②肝功能异常者；③感染或并发有其他皮肤病者；④有其他心、肝、肾脏严重疾病者；⑤自身免疫缺陷者。选择同期我院120 例健康产检孕妇作为对照组，年龄20～35(26.54±3.41)岁；孕周36～40(38.14±1.76) 周；平均BMI 25.98±2.43kg/m2；孕次1～4（2.37±0.18）次，两组基本资料比较差异均无统计学意义（P=1.424,0.733,1.600,P＞0.05），具有可比性。本研究只纳入非人工授精者。所有研究对象均签署知情同意书，本研究已获得医院伦理委员会的批准（批号：18-625）。

1.2 试剂与仪器 生化指标检测：总胆汁酸（total bile acid，TBA）试剂盒（上海名劲生物科技有限公司，货号：B3452）；丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）试剂盒（上海酶研生物科技有限公司，货号：EK-H12224）；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）试剂盒（上海广锐生物科技有限公司，货号：180）。qRT-PCR 仪（美国Bio-Rad 公司型号：CFX384）；TRIzol 试剂（上海佰利莱生物科技有限公司，货号：BLL-Bytd0054）；荧光定量PCR 试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司，货号：23444）；M-MLV 反转录试剂盒（北京普非生物科技有限公司，货号：PR2555）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：采集ICP 孕妇以及健康分娩孕妇清晨空腹时静脉血5ml，4 000 r/min（离心半径10 cm）离心5 min，分离血清，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.2 临床资料采集及生化指标检测：收集所有受试者孕妇不良妊娠结局资料包括：自发性早产、产后出血、羊水胎粪污染、宫内窘迫、小于胎龄儿（体重小于同胎龄儿平均体重的第5 个百分位）、低出生体重儿[10]。TBA，ALT，AST 生化指标检测采用全自动生化分析仪（cobas c 311，罗氏诊断产品有限公司）检测。根据孕妇空腹血清TBA 水平分成[11]：轻度ICP 组（TBA 水平为10～40 μmol/L，n=46）和重度ICP 组（TBA＞40 μmol/L，n=80）。

1.3.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清PDCD4，GLUT1 表达水平：使用TRIzol 试剂提取血清样本中的总RNA，反转录成cDNA 后进行qRTPCR 反应，qRT-PCR 检测条件：95℃预变性5 min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸15s，共循环35 次。以β-actin 为内源对照，以2-ΔΔCt的方法计算PDCD4 和GLUT1 的表达水平。引物由上海吉凯基因技术有限公司完成，引物序列：PDCD4 正向引物5’-GCAAAAAGGCGACTAAGGAAAAA-3’，反向引物5’-GGCATCAACGCTGTCTTCTAT-3’；GLUT1 正向引物5’- TAAGGGCGTCACTCCCACT-3’，反向引物5’- CACAAACAGCGACACGACAGT-3’；β-actin 正向引物5’- GAAGATCAAGATCATT GCTCCT-3’，反向引物5’- TACTCCTGCTTGCTGA TCCACA -3’。

1.4 统计学分析 采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用例（n）或百分比（%）表示，组间比较采用卡方（χ2）检验；多因素Logistic 回归分析影响ICP 孕妇妊娠结局的因素；Pearson 法分析PDCD4，GLUT1 水平的相关性。P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组与对照组生化指标以及血清PDCD4，GLUT1 水平比较 研究组TBA（65.25±5.87μmol/L），ALT（54.52±3.66U/L），AST（49.98±4.58U/L），PDCD4（1.36±0.23），GLUT1（1.40±0.22）水平均高于对照组（3.52±0.13μmol/L，20.87±2.15 U/L，18.46±3.45 U/L，1.02±0.21，0.99±0.18），差异具有统计学意义（t=115.161，83.371，60.741，12.090，15.953，均P=0.000）。

2.2 重度ICP 与轻度ICP 患者生化指标以及血清PDCD4，GLUT1 水平比较 重度ICP 组TBA（86.02±7.26μmol/L），ALT（72.57±4.51U/L），AST（65.84±5.41U/L），PDCD4（1.41±0.25），GLUT1（1.45±0.22） 水平均高于轻度ICP 组（29.14±3.45μmol/L，23.14±2.18 U/L，22.41±3.15 U/L，1.27±0.20，1.31±0.21），差异具有统计学意义（t=49.932，69.714，49.761，3.246，3.496；P=0.000，0.000，0.000，0.002，0.001）。

2.3 研究组与对照组妊娠结局比较 见表1。研究组羊水胎粪污染、自发性早产、产后出血、宫内窘迫等不良妊娠结局的发生率均高于对照组，两组比较差异有统计学意义（χ2=1.049～29.159，均P＜0.05）。研究组总的妊娠结局明显高于对照组[60(47.61%) vs 10(8.33%)]，差异有统计学意义(χ2=45.596,P=0.000)。

表1 研究组与对照组妊娠结局比较[n（%）]

2.4 ICP 妊娠结局良好和妊娠结局不良患者一般资料及血清PDCD4，GLUT1 比较 见表2。以PDCD4 均数为临界值进行划分，将≤1.36 的患者纳入低表达，＞1.36 的患者纳入高表达；以GLUT1均数为临界值进行划分，将≤1.40 的患者纳入低表达，＞1.40 的患者纳入高表达，结果显示妊娠结局良好组和妊娠结局不良组患者的发病程度、PDCD4，GLUT1 表达水平差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 ICP 妊娠结局良好和妊娠结局不良患者各指标比较[n（%）]

2.5 多因素Logistic 回归分析影响ICP 孕妇妊娠结局的因素 见表3。以ICP 孕妇妊娠结局不良为因变量（妊娠结局不良=1，妊娠结局良好=0），以发病程度（轻度=0，重度=1），PDCD4（低表达=0，高表达=1），GLUT1（低表达=0，高表达=1）表达水平为自变量进行多因素Logistic 回归分析，结果显示发病程度、PDCD4，GLUT1 为ICP孕妇妊娠结局不良的影响因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic 回归分析影响ICP 孕妇妊娠结局的因素

2.6 Pearson 相关性分析研究组血清PDCD4，GLUT1 水平的相关性 Pearson 相关性分析研究组血清PDCD4 与GLUT1 水平呈正相关（r=0.460，P＜0.05）。

3 讨论

ICP 是一种妊娠期妇女肝脏损伤的常见病因，可增加胎儿窘迫、羊水粪染、早产的发生率，甚至可造成死胎、死产，影响出生人口质量。由于ICP发病机制复杂，后期若处理不当，将会对产妇和围产儿的生命等造成较大的威胁，因此及早检测以及尽早发现对于预防和诊治ICP 有重大意义。目前对于ICP 的诊断，国际上尚无统一意见。研究表明，TBA 对于ICP 的诊断价值较高，另外当ICP患者肝功能出现不同程度的炎性反应时，多数患者ALT，AST 会呈现不同程度的升高趋势，进而对孕妇以及胎儿造成严重的不良影响[12-14]。临床试验和观察性研究的证据均显示，当孕妇的血清TBA 浓度高于实验室界定的临界上限值后，其疾病的严重程度与围产期不良妊娠结局风险增加相关，如死产、早产、羊水胎粪污染、胎儿窘迫、胎儿窒息等[15]。本研究ICP 患者TBA，ALT，AST 水平显著高于对照组，与王之萍等[16]的研究结果相似。分析其原因可能是TBA 水平升高时，影响了胎盘功能，胎盘血流受阻，同时胎儿的血流灌注减少及血氧供应不足，导致孕妇妊娠结局不良。

PDCD4 是一种重要的抑癌基因，近年来研究发现其参与了许多疾病的病理、生理过程，尤其是在炎症反应和细胞死亡过程中发挥重要作用[17]。有报道称miR-21 可靶向PDCD4 调控胎盘滋养细胞的侵袭和凋亡[18]。FENG 等[19]研究表明PDCD4 主要在滋养细胞胞质（细胞滋养细胞和合体滋养细胞）中，PDCD4 在ICP 胎盘组织中的表达高于健康对照组，miR-21-5p 的敲低增加了下游基因PDCD4 的表达，增加了细胞凋亡。本研究中PDCD4 在ICP 患者血清中表达水平显著高于对照组，且ICP 重度组高于ICP 轻度组，与前人研究结果一致，提示了PDCD4 可能促进了胎盘滋养细胞的过度凋亡，对妊娠中晚期孕妇的健康造成一定的威胁。GLUT1 作为葡萄糖转运蛋白家族成员之一，是介导细胞葡萄糖转运的重要载体，其作用是参与葡萄糖跨膜运输正常的生理过程。研究表明GLUT1 在胎盘滋养细胞的基底膜和微绒毛中均有表达[20]，胎盘组织中GLUT1 的表达升高可能是因为母体胎盘缺氧导致，但其具体机制尚不清楚[21]。景晓琳等[22]研究了miR-148b-3p 调节胎盘滋养细胞GLUT1 表达与ICP 子代糖代谢紊乱关系，发现GLUT1 蛋白在人滋养细胞中表达上调，胎盘组织GLUT1表达上调可能与受体内母体高葡萄糖水平、胎盘缺氧有关。本研究中GLUT1 在ICP 患者血清中的水平显著高于对照组，重度ICP 组GLUT1 水平高于轻度ICP 组，提示GLUT1 参与了ICP 的发生和发展，其动态变化可反映患者的疾病严重程度，可能与孕妇胎盘缺氧有关。

本研究多因素Logistic 回归分析显示发病程度、PDCD4，GLUT1 是影响ICP 孕妇妊娠不良结局的危险因素，提示ICP 患者中PDCD4，GLUT1 的异常表达与不良妊娠结局密切相关。陈昀等[23]研究发现GLUT1 蛋白水平相对较高，可能与糖酵解因素有关。苏瑞芬等[24]研究了PDCD4 在子痫前期患者胎盘组织中的表达情况，结果显示，PDCD4表达水平在子痫前期患者胎盘组织中表达上调，且与胎盘螺旋动脉重铸发生密切相关，并表明了PDCD4 表达升高会加剧滋养细胞凋亡，滋养细胞与肿瘤细胞的侵袭能力相似。当胎盘滋养细胞凋亡过多时会导致侵袭不足，引起孕妇胎盘功能受损。Pearson 相关性分析发现，PDCD4，GLUT1 水平呈正相关，提示PDCD4，GLUT1 可能发挥协同作用共同参与ICP 的发生。

综上所述，ICP 孕妇血清中PDCD4，GLUT1水平均升高，二者的异常表达对孕妇妊娠结局产生不良影响，可作为临床ICP 孕妇妊娠结局的预测指标，对可能出现妊娠结局不良的患者应尽早干预。本研究的局限性在于所研究的样本量有限，且对于血清PDCD4，GLUT1 水平对ICP 的具体作用机制尚不十分清楚，后期仍需要进一步扩大样本数量深入探讨二者在ICP 孕妇中的发病机制，为ICP 的诊断和鉴别提供新的理论依据和方向。