溃疡性结肠炎患者血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平及与预后相关性研究

王 飞，祝 靳，赵宝林（南京市浦口区中医院/南京市中医院浦口分院肛肠科，南京 211800）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）为慢性非特异性炎症疾病，其病程较长且易反复发作，可引起肠穿孔甚至癌变，因此，早期评估UC 的病情对于改善患者的预后具有重要意义[1-2]。UC 是一种炎症性疾病，抑制炎症是治疗UC 的一种有效方法，长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在免疫应答、炎症反应中发挥重要作用[3]。研究显示，LncRNA 心肌梗死相关转录本2（long non-coding RNA myocardial infarction-related transcript 2，LncRNA Mirt2）在UC 患者血浆中下调表达，且可调节结肠上皮细胞IL-22 的表达[4]。LncRNA 干扰素γ- 反义RNA1（long non-coding RNA interferon γ-antisense RNA 1，LncRNA IFNGAS1）可促进炎症因子的表达，在UC 中表达失调，是作为UC 的炎症增强子[5]。LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 与UC 临床上预后相关性尚未见报道，本研究探讨LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达情况与UC 患者预后相关性，为临床治疗提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究获得医院伦理委员会批准。选择2018年12月～2021年1月南京市浦口区中医院（南京市中医院浦口分院）收治的193 例UC患者作为观察对象，其中男性101 例，女性92 例，年龄32～65（47.40±6.80）岁。193 例UC 患者中缓解期85 例，活动期108 例，其中轻度43 例，中度35 例，重度30 例；根据患者预后情况分为复发组78 例和未复发组115 例。纳入标准：①符合UC 诊断标准[6]；②入院前未进行相关治疗；③所有患者知情并同意。排除标准：①伴有结肠狭窄、梗阻、肠道结核等肠道疾病；②并发严重心、肝、肾等系统疾病；③并发直肠癌等恶性肿瘤疾病者；④自身免疫性疾病患者；⑤伴有精神疾病患者；⑥妊娠或哺乳期女性。缓解期与活动期判断标准：采用Mayo 评分[6]评价，评分0～2 分为症状缓解，3～5 分为轻度活动，6～10 分为中度活动，11～12 分为重度活动。另选取同期190 例健康体检者作为对照组，其中男性97 例，女性93 例，年龄33～68（47.80±6.50）岁。观察组与对照组性别、年龄之间比较差异无统计学意义（χ2/t=0.063，0.588，均P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 总RNA 提取试剂（total RNA extraction reagent，TRIzol）试剂（货号15596026，Invitrogen 公司）；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit（货号ZY130911，泽叶生物科技有限公司）；SYBR Green 定量实时荧光定量PCR 仪（real time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR） 试剂盒（货号LM-0051，联迈生物科技有限公司）；白介素-6（interleukin-6，IL-6），肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒（联迈生物科技有限公司）；ABI 7500 型荧光定量PCR 仪（ABI 公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：分别采集UC 患者入院24h 内及对照者体检当天空腹静脉血5ml，3 000g 离心20min，分离血清，-80℃冷冻保存。

1.3.2 血清LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 表达水平检测：TRIzol 试剂提取总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA 后，采用qRT-PCR 实验检测血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1表达水平。LncRNA Mirt2 上游引物序列：5’-TCAACACT TTCCATAGGT-3’，下游引物序列：5’-ATTGTGAG GTCCAGATAG-3’；LncRNA IFNG-AS1上游引物序列：5’-GCTGATGATGGTGGCAATCT-3’，下游引物序列：5’-TTAGCAGTTGGTGGGCTTCT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAG CG-3’，下游引物序列：5’-ACCACCCTGTTGCTG TAGCCAA-3’；反应结束后，以GAPDH 为内参采用2-ΔΔCt计算相对表达水平。

1.3.3 血清C 反应蛋白（C-reactive protein，hCRP），IL-6 和TNF-α 水平检测：采用免疫比浊法检测血清CRP 水平，酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法检测IL-6，TNF-α 表达水平，具体操作严格按照操作说明进行。

1.3.4 随访：对所有UC 患者进行为期一年的随访，采用门诊或电话随访方式，每二个月随访一次，随访截止时间为2022年1月31日，随访终点为患者复发或随访结束。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，计数资料采用（n，%）表示，采用卡方检验；Pearson 法分析UC 患者血清LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 表达水平相关性及LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 与CRP，IL-6，TNF-α 的相关性；受试者工作特性（receiver operator characteristic curves，ROC）曲线分析血清LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 对复发UC 的诊断价值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1表达水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平比较 见表1。缓解期组与活动期组UC 患者血清LncRNA Mirt2表达水平低于对照组，LncRNA IFNG-AS1 表达水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平高于对照组，差异均有统计学意义（t=10.064,26.235,24.745,28.629,19.473；27.847,27.488,44.632,40.715,19.998，均P＜0.001）；活动期组UC 患者血清LncRNA Mirt2表达水平低于缓解期组，LncRNA IFNG-AS1 表达水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平高于缓解期组，差异均有统计学意义（t=16.210，12.420，14.600，15.275，16.844，均P＜0.001）。

表1 三组血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平比较（±s）

表1 三组血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平比较（±s）

项目对照组（n=190）缓解期组（n=85）活动期组（n=108）F 值P 值LncRNA Mirt21.07±0.120.92±0.100.71±0.08400.428＜0.001 LncRNA IFNG-AS11.01±0.141.63±0.252.27±0.42758.421＜0.001 CRP（mg/L）4.32±1.2713.42±4.7125.38±6.29910.667＜0.001 IL-6（pg/ml）2.87±0.788.31±2.3516.55±4.52886.585＜0.001 TNF-α（pg/ml）8.42±1.6315.38±4.29*28.94±6.37862.592＜0.001

2.2 活动期不同严重程度UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG AS1 表达水平比较 见表2。中、重度组UC 患者血清LncRNA Mirt2 表达水平低于轻度组，LncRNA IFNG-AS1 表达水平高于轻度组，差异均有统计学意义（t=7.567，17.225；3.890，13.621，均P＜0.001）；重度组UC 患者血清LncRNA Mirt2 表达水平低于中度组，LncRNA IFNG-AS1 表达水平高于中度组，差异均有统计学意义（t=6.184，5.957，均P＜0.001），

表2 活动期不同严重程度UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达水平比较（±s）

表2 活动期不同严重程度UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达水平比较（±s）

项目轻度组（n=43）中度组（n=35）重度组（n=30）F 值P 值LncRNA Mirt20.81±0.060.69±0.080.58±0.05113.038＜0.001 LncRNA IFNG-AS11.90±0.312.25±0.482.83±0.2558.739＜0.001

2.3 UC 患者血清LncRNA Mirt2 与LncRNA IFNGAS1 表达水平及与CRP，IL-6，TNF-α 相关性相关性分析显示，UC 患者血清LncRNA Mirt2 与LncRNA IFNG-AS1 表达水平呈负相关（r=-0.540，P＜0.001）。UC 患者血清LncRNA Mirt2 表达水平与CRP，IL-6，TNF-α 呈负相关（r=-0.623，-0.605，-0.571，均P＜0.001），LncRNA IFNG-AS1表达水平与CRP，IL-6，TNF-α 呈正相关（r=0.457，0.531，0.497，均P＜0.001）。

2.4 UC患者不同预后血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达水平比较 复发组UC 患者血清LncRNA Mirt2 表达水平显著低于未复发组（0.70±0.08 vs 0.87±0.11），LncRNA IFNG-AS1 表达水平显著高于未复发组（2.38±0.41 vs 1.72±0.28），差异有统计学意义（t=11.706，13.294，均P＜0.001）。

2.5 血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 对复发UC 的诊断价值 见图1。血清LncRNA Mirt2诊断复发UC 的曲线下面积为0.850（95%CI：0.792～0.897），截断值为0.82，敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为79.49%，78.26%，71.26%，84.91% 和78.76%。血清LncRNA IFNG-AS1 诊断复发UC 的曲线下面积为0.893（95%CI：0.841～0.933），截断值为2.06，敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为80.77%，81.74%，75.00%，86.24%和81.35%。血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1联合诊断复发UC 的曲线下面积为0.931（95%CI：0.886～0.963），敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为87.18%，86.96%，81.93%，90.91%和87.05%。

图1 血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 对复发UC 的预测价值

3 讨论

LncRNA 在调节细胞生长、炎症反应、胚胎发育、免疫调节等过程发挥重要作用[7]。报道显示，LncRNA 在克罗恩病、结肠癌等肠道疾病中表达水平异常，可通过促进炎症细胞浸润、调节结肠上皮细胞凋亡、免疫细胞功能等参与UC 的发生发展[8]。LncRNA Mirt2 可调节巨噬细胞极化，抑制Lys63(K63)-连接肿瘤坏死因子受体相关因子6 的泛素化，从而抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路的激活，抑制促炎细胞因子的产生[9]。LncRNA IFNG-AS1 可调控促炎症因子的生成，与多种炎症性疾病有关[10]。在冠心病(coronary heart disease，CAD)患者血浆LncRNA IFNG-AS1 表达水平升高，与疾病严重程度增加和炎症因子水平呈正相关[11]。研究显示，UC 患者血浆中LncRNA Mirt2 表达水平降低，LncRNA IFNGAS1 表达水平升高，二者对UC 有一定诊断价值，体外研究显示，LncRNA Mirt2，LncRNA IFNGAS1 均参与调控结肠上皮凋亡[12]。

本研究结果显示，UC 患者血清LncRNA Mirt2表达水平显著降低，LncRNA IFNG-AS1 表达水平显著升高，与报道结果类似，且LncRNA Mirt2 表达水平随UC 病情加重而降低，LncRNA IFNG-AS1表达水平随UC 病情加重而升高，提示LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达失调与UC 的发生发展有关，这可能与LncRNA Mirt2 发挥抗炎作用而LncRNA IFNG-AS1 发挥促炎作用有关，研究显示，LncRNA Mirt2 可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶信号通路抑制miR-101 表达，抑制脓毒症大鼠心肌炎症反应，从而改善心脏结构和功能[13]。另有研究显示，脓毒症患者血清LncRNA IFNG-AS1表达升高，与疾病严重程度及血清CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-8 水平呈正相关[14]。因此推测LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 在UC 的作用可能是LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 通过影响结肠上皮增殖与凋亡增殖、炎症反应而在UC 的发展进程中发挥作用。

UC 的发病与遗传、感染、免疫等多种因素有关，在外界因素的刺激下，触发机体的免疫反应和炎症发生。报道显示，UC 患者血清IL-6，IL-15，CRP水平升高与患者预后相关[15]。CRP 为炎性标志物，IL-6，TNF-α 为促炎因子[16]，本研究显示，UC 患者炎症因子水平升高，且与患者病情严重程度有关，表明UC 患者病情越严重，机体炎性水平越高。相关性分析显示，UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表达水平与炎症因子均具有相关性，提示LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1水平可用于评估UC 病情严重程度及机体的炎症反应状态。本研究还显示，UC 患者血清LncRNA Mirt2 与LncRNA IFNG-AS1 表达水平呈负相关，提示LncRNA Mirt2 的抗炎作用和LncRNA IFNGAS1 促炎作用的失衡促进UC 的炎性进展。报道显示，UC 的发生与Th1/Th2 细胞免疫失衡有关[17]，而LncRNA IFNG-AS1 的过表达可上调Th1 炎症因子表达，下调Th2 抗炎因子表达[18]。而LncRNA Mirt2 可抑制NF-κB 和MAPK 通路的激活抑制炎症反应，因此LncRNA Mirt2 表达水平降低，抗炎作用减弱，而LncRNA IFNG-AS1 表达水平升高，促炎作用增强，二者可能共同参与调控UC 的炎症反应，加重肠黏膜组织损伤，引发肠黏膜屏障功能障碍。

本研究还显示，复发组UC 患者血清LncRNA Mirt2 表达水平显著低于未复发组，LncRNA IFNGAS1 表达水平显著高于未复发组，提示LncRNA IFNG-AS1 可能作为UC 患者的预后标志物。进一步研究发现，血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNGAS1 联合对于复发UC 有一定诊断价值，提示血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 水平联合检测对于预测UC 患者预后有一定价值，有一定临床应用意义。本研究纳入样本量较少为本研究不足之处，其临床应用仍需扩大样本量做更深入的研究。

综上所述，UC 患者血清LncRNA Mirt2 表达水平降低，LncRNA IFNG-AS1 表达水平升高，与炎症水平和患者预后有关，可作为反映UC 患者病情与预后的标志物。