磷脂酶D 的大肠杆菌表达系统及其转酰基催化活性

程青，谢志鹏

（浙江大学 医学院 药物生物技术研究所，浙江 杭州 310058）

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）是生物膜磷脂的重要组成成分［1］，可以调控细胞膜中关键蛋白质的功能状态［2］、平衡情绪［3］、改善记忆力［4］和缓解阿尔茨海默氏病症状［5］、增强运动员的恢复能力［6］。目前，PS 的制备方法主要有化学提取法和生物酶催化法。化学提取法成本高、产率低，且动物原料存在安全隐患［7］。生物酶催化法，以磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）和L-丝氨酸为原料，以磷脂酶D（phospholipase D，PLD）为催化剂，简单高效，反应温和，更适合PS的规模化生产［8］。

PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 种反应：（1）水解反应，催化PC 的磷酸二酯键水解，生成磷脂酸和胆碱；（2）转酰基反应，将PC 的磷脂头部转移至其他受体醇［9-10］。PLD 广泛存在于动植物以及微生物的生物膜中［11］。相对于动植物来源的PLD，微生物来源的PLD，尤其是链霉菌属（Streptomyces）来源的PLD，具有更强的转磷脂能力和更广泛的底物专一性［12］。

野生链霉菌表达PLD 发酵周期长且酶活水平低，目前获得PLD 的常用手段是对PLD 进行分子改造，将其异源表达到其他工程菌。大肠杆菌具有生长周期短、培养成本低、易于操作等优点，是PLD 的主要异源表达系统，也有研究利用其他宿主菌表达PLD，如毕赤酵母、变铅链霉菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等。LIU 等［13］在毕赤酵母表面展示PLD，当诱导108 h 时，转酰基活力达到最大，为315 U·g-1（细胞干重），但与大肠杆菌表达PLD 相比，发酵周期过长。NAKAZAWA 等［14］通过构建大肠杆菌-变铅链霉菌穿梭质粒，在变铅链霉菌中分泌表达PLD，培养60 h 后酶活高达30 U·mL-1，但需经硫酸铵沉淀，从培养基上清中分离PLD 蛋白。HUANG 等［15］利用枯草芽孢杆菌WB600 分泌表达PLD，但需将发酵液经过镍柱洗脱得到纯PLD。HOU 等［16］首次使用谷氨酸棒杆菌分泌表达PLD，但从培养基上清中获得的PLD 粗酶液，需使用较为昂贵的脑浸出液培养基。由于PLD 的表达对大肠杆菌宿主有毒害作用，在不诱导时，PLD 的微量渗漏表达也会导致其细胞死亡或质粒丢失［17］，从而令PLD 产量降低。XIONG 等［18］将大肠杆菌作为PLD 表达宿主，在质粒中加入稳定基因，使用严谨型启动子，质粒稳定性在传代5 次后仍为100%，5 L 发酵罐中的酶活达120 U·mL-1，但需经硫酸盐沉淀、镍柱洗脱等复杂纯化过程。ZHANG 等［19］通过自转运蛋白ADIA-I，在大肠杆菌表面展示PLD，虽然避免了PLD 的纯化，但诱导48 h后，酶活仅为0.074 U·mL-1。目前，已有的PLD 表达方式存在细胞发酵周期长、分离纯化步骤烦琐、培养成本较高等问题。

本研究旨在通过系统性地对比研究大肠杆菌胞内表达、分泌表达和表面展示3 种方式对PLD 酶活及其PS 催化合成效率的影响，探索全细胞催化制备PS 的可行性及最适方式，以期大幅缩短PLD 高效活性表达所需的发酵时长，优化操作烦琐、耗时、成本高昂的PLD 分离纯化工序。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21（DE3）和克隆宿主Escherichia coli DH5α 菌株均为实验室保藏。

1.1.2 主要酶与试剂

胆碱氧化酶购于上海源叶生物科技有限公司，辣根过氧化物酶购于上海生工公司，磷脂酰胆碱（98%）、磷脂酰丝氨酸（99%）购于Sigma-Aldrich 公司，L-丝氨酸（99%）购于上海麦克林生化科技公司。

1.2 方 法

1.2.1 重组菌株的构建

构建胞内表达、分泌表达和表面展示3 种方式的PLD 表达重组菌株，见表1。

表1 表达PLD 的菌株Table 1 The strains for expression of PLD

胞内表达菌株BL-PLD。基于大肠杆菌密码子偏好性，优化Streptomyces halstedii 来源的pld 基因（AB062136.1），由擎科生物公司合成，转化至BL21（DE3）菌株而得。

采用限制性内切酶Hind III 和BamH I 对合成的pET28a（+）-PLD 载体和pET22b（+）空载体进行双酶切，连接后得到重组质粒pET22b（+）-PLDp。以pET22b（+）-PLDp 为模板，将pelB 信号肽分别替换为FhuD、OmpA、DsbA 信号肽，得到分泌表达载体pET22b（+）-PLDo、pET22b（+）-PLDd、pET22b（+）-PLDf，转化至BL21（DE3）菌株，得到分泌表达菌株PLD-PelB、PLD-OmpA、PLDDsbA、PLD-FhuD。所用信号肽及其序列如表2所示。

表2 分泌表达载体及其信号肽Table 2 Secreted expression vectors and their signal peptides

表面展示菌株PLD-EhaA。N 端CtxB 信号肽序列、EhaA 自转运蛋白连接子区域、β 折叠区域由擎科生物公司合成，插入pET28a（+）-PLD 载体。将重组质粒转入BL21（DE3）进行蛋白表达。

1.2.2 水解酶活检测

由于PLD 的转酰基酶活检测方法烦琐、耗时，而PLD 的水解酶活与转酰基酶活存在正相关性［20］，且水解酶活检测方法简便、快速，故在进行条件优化时用水解酶活表征转酰基酶活。采用酶连比色法［21］，通过检测胆碱的物质的量测定水解酶活。PLD 的一个水解酶活单位（U）定义为每分钟催化底物PC 水解产生1 μmol 胆碱所需的酶量。

分别取胞内表达菌株和分泌表达菌株的发酵液1 mL，离心后，用Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液重悬菌体，超声破碎，得到PLD 粗酶液。稀释一定倍数后，取100 μL 进行水解酶活检测。取表面展示菌株发酵液1 mL，离心后用缓冲液重悬稀释菌体，取100 μL 细胞悬液检测酶活。

1.2.3 PLD 转酰基反应合成PS

在水-乙酸乙酯两相体系中，分别以全细胞和来源于胞内表达菌株、分泌表达菌株的粗酶液为催化剂，催化PC 和L-丝氨酸合成PS［22］。两相反应体系混合液包括3 mL 含10 mg·mL-1PC 的乙酸乙酯溶液、1 mL 含90 mg·mL-1L-丝氨酸和15 mmol·L-1CaCl2的乙酸钠缓冲液（100 mmol·L-1，pH 5.5）、0.5 mL 粗酶液或全细胞悬液。将混合液置于40 ℃、200 r·min-1摇床中振荡12 h，加入4.5 mL Floch 溶液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），离心后取有机相，采用高效液相色谱（HPLC）法测定磷脂。

在纯水相体系中，在LIU 等［13］方法的基础上略做了修改。纯水相反应体系混合液包括1 mL 含10 mmol·L-1PC 的5% Triton X-100 溶液、1 mL 含40 mmol·L-1L-丝氨酸的100 mmol·L-1乙酸钠缓冲液（pH 5.5）、150 μL 含10 mmol·L-1CaCl2水溶液及1 mL 粗酶液或全细胞悬液。将混合液置于40 ℃、200 r·min-1摇床中振荡12 h。采用HPLC 法测定磷脂。

1.2.4 高效液相色谱检测

采用配备紫外检测器的安捷伦1260 高效液相色谱仪，选用安捷伦ZORBAX Rx-SIL 硅胶色谱柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），以乙腈、甲醇、85% 磷酸混合液（V∶V∶V=100∶10∶0.8）为流动相，流速1 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长205 nm。

1.2.5 扫描电镜制样及观察

（1）固定：将细菌样品悬浮于0.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定过夜。倒掉固定液，用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗样品3 次，每次15 min。再用1%锇酸溶液固定样品1～2 h，小心取出锇酸废液，用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗样品3 次，每次15 min。

（2）脱水：依次用体积分数为30%，50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min。最后用无水乙醇脱水处理20 min，并将细胞样品保存于无水乙醇中。

（3）干燥：在Hitachi HCP-2 型临界点干燥仪中干燥。

（4）观察：镀膜，将处理好的样品置于Hitachi SU-8010 型扫描电镜中观察。

1.2.6 重组PLD 的表达及发酵条件优化

LB（Luria-Bertani）液体培养基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1。将重组菌BL-PLD 接种至50 mL LB 液体培养基，37 ℃ 220 r·min-1摇床过夜培养，得种子液。

MTB（Modified Terrific Broth）培养基：胰蛋白胨12 g·L-1，酵母提取物24 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，K2HPO472 mmol·L-1，KH2PO472 mmol·L-1。将1%种子液接种至150 mL MTB 培养基，37 ℃、220 r·min-1培养至菌浓（发酵液在600 nm 处的吸光度）为0.4～0.6，添加IPTG 至浓度为0.1 mmol·L-1，于25 ℃、220 r·min-1继续发酵培养。

采用单因素法，分别探究诱导温度、诱导时的OD600、IPTG 浓度、诱导时长等对PLD 表达量的影响。

2 结果与讨论

2.1 重组菌株

2.1.1 胞内表达菌株

经过优化，胞内表达菌株的密码子适应性指数（CAI）从0.71 提升至0.96，DNA 序列中鸣嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的碱基对的占比（GC 含量）从71%降至52%。

2.1.2 分泌表达菌株

信号肽是用于指导目的蛋白跨膜转移或定位的氨基酸序列。通过将适当的信号序列融合至靶蛋白基因的N 端，如大肠杆菌宿主，令异源蛋白分泌至周质空间，从而增强其溶解度并避免形成包涵体。不同信号肽分泌蛋白的途径不同，参照文献［23］，选择PelB、OmpA、FhuD 和DsbA 4 种信号肽，研究不同信号肽对PLD 分泌表达的差异。

2.1.3 表面展示菌株

ZHANG 等［19］通过自转运蛋白AIDA-I 将PLD成功展示在大肠杆菌细胞表面［19］，说明将大肠杆菌作为PLD 展示菌株是可行的，但诱导48 h 后酶活仅为0.074 U·mL-1，可能是因为自转运蛋白AIDA-I的转运效率较低。另外，TOZAKIDIS 等［24］借助自转运蛋白EhaA 成功将酯酶展示在大肠杆菌细胞表面，且获得较高的酶活，故选择自转运蛋白EhaA 在大肠杆菌表面进行展示。

EhaA 是来自大肠杆菌O157：H7 EDL933 基因组的一种自转运蛋白，其与PLD 融合的自转运系统结构如图1（a）所示，包括三部分：（1）N 端的CtxB信号肽［25］；（2）C 末端的自转运蛋白EhaA，包含连接子和β-折叠区域［26］；（3）PLD 作为“乘客”蛋白，位于N 端与C 端之间。PLD 转运过程如图1（b）所示，CtxB 信号肽通过Sec 引导PLD 蛋白穿过内膜转运［27］至周质空间，同时信号肽被裂解。通过形成孔状结构，将β-折叠结构域整合至细胞外膜，而连接子结构域穿过β-折叠结构域并充当连接结构，以允许PLD 蛋白暴露在细胞外部。

图1 EhaA 自转运载体示意Fig.1 Schematic of EhaA autotransporter

2.2 发酵条件优化

图2 展示了诱导温度、诱导时的OD600、诱导物浓度对大肠杆菌表达PLD 的影响。

图2 PLD 发酵条件优化Fig.2 Optimization of the fermentation conditions

首先，在16～32 ℃条件下诱导PLD 表达，发酵结束后检测PLD 的水解酶活。图2（a）表明，在20 ℃时，PLD 水解酶活最高。随着温度上升，酶活急剧下降，说明PLD 更倾向于较低温度的诱导表达，温度对PLD 的诱导表达较为关键。

其次，为探究诱导时的最佳细胞量，分别在OD600为0.4～1 时进行诱导。图2（b）表明，当OD600=0.7时，PLD 水解酶活最高。若过早诱导PLD 表达，则不利于菌体生长，PLD 最终表达量较低，说明在诱导PLD 表达前需积累足够多的细胞量。当OD600＞0.7 时，随着OD600的增加，酶活反而降低，这可能是由于菌体生长已经偏离了对数生长期，菌体活力下降，导致PLD 表达量下降。

最后，为探究PLD 表达的最佳IPTG 浓度，设置IPTG 浓度为0.05～1.50 mmol·L-1。图2（c）表明，0.3 mmol·L-1的IPTG 可获得最佳PLD 酶活。当IPTG 浓度超过0.4 mmol·L-1时，随着浓度的升高，酶活反而降低，这可能是由于浓度过高导致PLD 形成没有活性的包涵体，且过高浓度的IPTG 对细胞具有毒害作用，影响细胞生长，从而降低酶活。

2.3 诱导时长对酶活的影响

图3 展示了不同PLD 表达菌株的诱导时长与PLD 水解酶活的关系。随着诱导时长的增加，PLD 水解酶活不断升高。当诱导达8 h 时，胞内表达菌株BL-PLD 的水解酶活最高，为0.35 U·mL-1；分泌表达菌株中的PLD-PelB 水解酶活次之，为0.23 U·mL-1；表面展示菌株PLD-EhaA 的水解酶活较低，为0.11 U·mL-1。这可能是由于胞内表达菌株和分泌表达菌株的细胞经超声破碎后，粗酶液中的PLD与底物PC 的接触更加充分，故在检测酶活的较短时间内，其水解酶活较全细胞的PLD-EhaA 更高。

图3 诱导时长对PLD 水解酶活的影响Fig.3 Effect of induction time on PLD hydrolysis activity

在分泌表达菌株中，PLD-PelB的水解酶活最高；其次是PLD-FhuD，其酶活为0.17 U·mL-1；PLDOmpA 和PLD-DsbA 的酶活均在0.10 U·mL-1左右。所以，选择PelB信号肽做进一步研究。

总之，在PLD 的N 端连接信号肽后，其酶活反而比未连接信号肽的菌株更低。这与MISHIMA等［28］的研究结果类似，由于PLD 蛋白被信号肽转移至周质空间后不断积累，可能对宿主细胞有害，也可能导致质粒不稳定甚至丢失，从而降低酶活。

收集诱导表达PLD 8 h 的大肠杆菌细胞，用扫描电镜观察3 种方式下大肠杆菌细胞的形态变化，如图4 所示。无质粒的对照菌株细胞结构完整，呈短杆状，两端钝圆形，如图4（a）所示。在3 种表达方式下大肠杆菌细胞结构均受到一定程度的破坏，如出现不同程度的变形、断裂、塌陷等，有的细胞表面形成孔洞，有的细胞裂解出内容物，如图4（b）～（d）所示。其中，分泌表达菌株PLD-PelB 的细胞变形塌陷情况最为严重。与对照菌株相比，分泌表达菌株和胞内表达菌株的细胞表面更光滑。此外，表达PLD 蛋白之后的细胞更长，这可能是由于PLD 会影响细胞的有丝分裂，促进细胞增殖［29］。

图4 大肠杆菌的扫描电镜结果Fig.4 Scanning electron microscope images of E.coli.

综上，诱导PLD 表达的最佳条件为温度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 浓度0.3 mmol·L-1，诱导时长8 h。

2.4 PLD 转酰基反应合成PS

2.4.1 反应介质对酶促合成PS 产率的影响

菌株BL-PLD 诱导8 h 后，以1 mL 发酵液破碎后的粗酶液为催化剂，在40 ℃下反应12 h 制备PS。比较了纯水相和两相体系的PS 产率，如图5（a）所示。在纯水相体系中，PS 产率仅为13.71%，是两相体系中PS 产率的40%。这是因为在PLD 与底物PC 反应过程中，存在生成磷脂酸的副反应，而纯水相体系会促进磷脂酸的生成［30］，导致PS 产率下降。故选择用两相体系制备PS。

图5 PS 产率液相检测结果Fig.5 HPLC analysis of PS yield

2.4.2 不同PLD 表达方式对PS 产率的影响

为进一步获取PLD-EhaA、PLD-PelB 和BLPLD 3 种菌株的PS 产率，在诱导8 h 后离心收集菌体，按1 g 细胞加15 mL 缓冲液的比例，分别添加对应体积的Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液，重悬菌体，取1 mL 细胞悬液催化PC；另取1 mL 超声破碎粗酶液催化PC，结果如图5（b）所示。可知，无论是使用粗酶液还是全细胞催化PC，PLD-EhaA 的PS 产率均较高，其中全细胞催化的PS 产率可达59.1%；PLDPelB 和BL-PLD 的PS 产率均在30%左右。

对于PLD-PelB 和BL-PLD 菌株，细胞经超声破碎后，PLD 粗酶液与底物PC 接触更加充分，反应效率更高，故粗酶液催化的PS 产率比全细胞催化高。在两相体系反应前期，可能粗酶液催化底物PC产生PS 的速率较快，但在反应后期，有机溶剂影响了酶的结构，进而影响PLD 酶活［31］。故反应12 h后，粗酶液催化与全细胞催化PS 产率相差不大。

对于PLD-EhaA 菌株，大肠杆菌细胞通过EhaA 转运蛋白，将PLD 转移至细胞外膜。全细胞催化PC 能避免有机溶剂与酶液直接接触，从而保持PLD 酶活。故PLD-EhaA 菌株全细胞催化PC的PS 产率较细胞破碎粗酶液催化的高。

在大肠杆菌细胞表面展示PLD 的优势在于，大肠杆菌产生的酶被连接并固定在细胞表面，避免了费时费力且昂贵的酶分离纯化步骤［32］，且底物或产物均不需穿过细胞膜屏障［33］，大大降低了传质阻力。此外，PLD 表面展示方式还可用于PLD 固化，更适合规模化制备PS。总之，PLD 表面展示是降低生物催化转化过程成本的一种非常有效的方法。

3 结论

利用大肠杆菌表达系统，研究了胞内表达、分泌表达和表面展示3 种方式对PLD 酶活及其磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）催化合成效率的影响。结果表明，大肠杆菌表达PLD 的最佳诱导条件为温度20 ℃，OD600=0.7，IPTG 浓度0.3 mmol·L-1。在最适条件下，3 种方式的PLD 水解酶活均在诱导表达8 h 时达最高值，分别为0.35，0.23，0.11 U·mL-1。进一步比较了胞内表达菌株、分泌表达菌株以及表面展示菌株的PS 产率，结果表明，在水-乙酸乙酯两相体系中，PLD 表面展示菌株的PS 产率最高，为59.1%。采用自转运蛋白EhaA 对PLD 进行表面展示，用全细胞催化底物，后期不需要对蛋白进行分离纯化，大大降低了底物或产物穿过细胞膜屏障的传质阻力。研究对工业化利用大肠杆菌生产PS 具有一定的指导意义。