响应面分析法优化银杏叶黄酮类化合物的提取工艺

伦 琦，乔镜澄，杨江南，刘海涛，武湘姝，文 文

（天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700）

银杏叶提取物复杂的化学成分中主要起药理活性作用的是黄酮类物质，其黄酮种类多达40 种。黄酮类化合物生理活性多种多样，具有治疗心血管系统疾病、抗致病菌、消除炎症、抗氧化、预防肿瘤等多重功效[1]。当前，银杏叶总黄酮的提取方法有超声辅助提取法[2]、超声酶辅助提取法[3]和微波辅助提取法[4-5]等。研究表明，超声波辅助提取法较强的空化效应可以破坏植物细胞壁的结构，加速物质的溶出。微波辅助提取法使得黄酮类化合物溶解性提高，有利于提取率的增加。当前，微波超声联合辅助提取银杏叶黄酮报道较少。魏欣等[6]在提取棕榈叶中酚酸时采用了微波超声交替提取法，大大提高了提取效率。冯婧等[7]利用微波-超声辅助联合提取银杏叶黄酮，提取率明显提高，王娜等[8]利用超声微波协同优化花生红衣原花青素的提取，其提取率也获得明显提高。因此本文采用微波-超声辅助联合提取法，并利用响应面法优化试验条件，提高了银杏叶黄酮的提取率，降低微波的功率以减少微波热效应对黄酮结构的损伤，为天然产物的高效提取及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

银杏叶：采自天津天狮学院校园；芦丁为优级纯（中国药品生物制品检验所，纯度≥98%）；无水乙醇；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠。

1.2 仪器与设备

SONICS 超声波细胞粉碎机，上海芃奇科技仪器有限公司；微波催化合成萃取仪，上海比朗仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计，费尔伯恩实业发展（上海）有限公司；高速万能粉粹机，上海科恒实业发展有限公司；高压蒸汽灭菌锅，松下电器有限公司。

1.3 总黄酮提取与测定

1.3.1 标准曲线的绘制

吸取芦丁标准液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 和6 mL 置于25 mL 容量瓶内，加蒸馏水至6 mL，加入5%亚硝酸溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度摇匀。测定OD510，绘制芦丁与吸光度的标准曲线。

1.3.2 总黄酮提取

将烘干的银杏叶磨成粉，过80 目筛，保存在低温避光的条件下。称取银杏叶粉末0.500 0 g，溶于60%乙醇，液料比120 ∶1（mL ∶g），采用微波催化合成萃取仪处理，微波功率定为150 W，时间4 min。后置于超声波细胞粉碎仪中处理，超声间隙为2 s、超声时间为2 s，超声功率228 W，时间3 min。离心转速1 500 r·min-1，离心处理时间5 min，取上清液备用[4,7]。

1.3.3 总黄酮含量测定

量取样品处理液2 mL，置于25 mL 量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混匀，静置6 min 后，加10% Al(NO3)3溶液1 mL，混匀，静置6 min。加4% NaOH 试液10 mL，加水定容至刻度线，混匀，510 nm 波长下测定吸光度。

1.3.4 总黄酮含量的计算

按1.3.1 测得的吸光度值，得出标准曲线为y=0.011 8x+0.002（R2=0.999 7），利用公式（1）计算总黄酮类化合物的提取量[7]。式中：A为OD510处的吸光值；B为稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为银杏叶干粉质量，g。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 乙醇浓度

称取0.500 g 的银杏叶粉末，乙醇浓度分别为50%、55%、60%、65%和70%，溶液50 mL，液料比为1 ∶120（g ∶mL）在微波功率为150 W 下微波处理4 min，在超声功率228 W 下超声3 min，离心取上清液。

1.4.2 超声处理时间

称取0.500 g 的银杏叶粉末，液料比为120 ∶1（mL ∶g），60%的乙醇溶液50 mL，在微波功率为150 W 下微波处理4 min，超声功率为228 W，超声处理时间分别是1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min，离心取上清液。

1.4.3 微波处理时间

称取0.500 g 的银杏叶粉末，液料比为120 ∶1（mL ∶g），60%的乙醇溶液50mL，在微波功率为150 W 下微波处理时间分别为2 min、3 min、4 min、5 min 和6 min，超声功率228 W 下超声处理3 min，离心取上清液。

1.4.4 液料比

称取0.500 g 的银杏叶粉末，液料比为60 ∶1、80 ∶1、100 ∶1、120 ∶1 和140 ∶1（mL ∶g），60%的乙醇溶液50 mL，微波功率为150 W，处理4 min，在超声功率228 W 下超声处理3 min，离心取上清液。

1.5 响应面优化方案

在单因素试验的基础上，采用响应面分析法以黄酮类化合物提取量为响应值，对黄酮化合物提取工艺进行优化，以获得黄酮类化合物的最佳工艺参数[9]。水平因素设计如表1 所示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度

由图1 可知，在液料比为120 ∶1（g ∶mL），微波功率150 W 下微波处理4 min，超声功率228 W下超声3 min 的条件下，当乙醇浓度60%时黄酮化合物提取量为26.57 mg·g-1，此时提取量最高。

图1 乙醇浓度对提取量的影响

2.1.2 超声处理时间

图2表明，在液料比为120 ∶1（g ∶mL），乙醇浓度为60%，微波功率150 W 下微波处理4 min，超声功率228 W 条件下，当超声3 min 时黄酮化合物提取量为28.36 mg·g-1，此时提取量最高。

图2 超声时间对提取量的影响

2.1.3 微波处理时间

由图3 可知，在液料比为120 ∶1（g ∶mL），乙醇浓度为60%，微波功率为150 W，超声功率228 W 超声处理3 min 的条件下，当微波处理时间为4 min 时黄酮化合物提取量为26.42 mg·g-1，此时提取量最高。

图3 微波时间对提取量的影响

2.1.4 液料比

由图4 可知，在乙醇浓度为60%，微波功率150 W 下微波处理4 min，超声功率228 W 超声处理3 min 的条件下，液料比不同时黄酮类化合物提取量不同。当液料比为120 ∶1（mL ∶g）时黄酮化合物提取量为26.60 mg·g-1，此时提取量最高。

图4 液料比对提取量的影响

2.2 响应面法优化

2.2.1 回归方程及方差的分析

结合单因素实验，利用Design expert 8.0 软件对乙醇浓度、超声时间、液料比及微波时间4 个因素来进行响应面试验，结果如表2、3 所示。

表2 实验设计与结果

表3 方差分析

得到银杏叶黄酮类化合物总提取量Y（mg·g-1）对A、B、C、D的二次多项回归方程为Y=28.36-0.016A-0.5 4B+0.5 5C-0.5 5D+0.0 4 8A C-0.0 8 7B C+0.14BD+0.042CD-0.25A2-0.93B2-1.19C2-1.53D2， 得到此模型的P＜0.000 1，证明此模型极显著，回归方程相关系数R2为0.989 5，模型拟合度较好，相关系数R2Adj=0.979 1，变异系数为0.6%，说明该回归方程可以解释97.91%的试验数据。F=94.59，F值越大，变量对响应值的影响就越大。可以认为，该试验中选取的4 个因素对于银杏总黄酮类的提取量具有一定的影响，可以利用该模型来得到银杏叶黄酮的最佳提取条件。

2.2.2 响应面分析

图5为各因素对响应值的影响，各因素对黄酮类化合物的影响的排序为D＞C＞B＞A，交互项对黄酮类化合物影响的排序为BD＞BC＞AC＞CD＞AB=AD，二次项对黄酮类化合物影响的排序为D2＞C2＞B2＞A2，与方差分析结果相同。根据响应面分析得到的最优提取条件为乙醇浓度63.15%、超声时间2.65 min、液料比116 ∶1、微波时间3.83 min，预测的黄酮化合物提取量为28.38 mg·g-1。利用此最佳工艺条件提取银杏叶内的总黄酮，得到的黄酮类化合物提取量为28.36 mg·g-1，与预测值较为符合。

图5 各因素响应面分析图

3 结论

本文运用微波萃取辅助超声联合提取黄酮类化合物的方法显著缩短了提取时间，提高了银杏叶中黄酮类化合物的提取量。在单因素的基础上，采用响应面法对银杏叶中的黄酮类化合物提取工艺参数进行优化。结果表明，最佳提取工艺为乙醇浓度63.15%、超声时间2.65 min、液料比116∶1（mL∶g）、微波时间3.83 min，此工艺条件下提取黄酮类化合物提取量为28.36 mg·g-1。