等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的研究

梁振瑞，张 薇，许绍坤，李鲜鲜，冯 红，自武全

（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）

沙门氏菌是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，是常见的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500 个以上[1-3]。人一旦摄入了含有大量沙门氏菌的食品，就会引起细菌性感染，进而导致食物中毒、急性肠胃炎等疾病，因此，沙门氏菌检测是各个国家检验机构的必检项目之一[4]。目前，检测沙门氏菌的方法有很多，如酶联免疫法[5]、PCR 法等[6]，但这些检测方法都存在检测过程烦琐、检测周期长的弊端[7]。近年来，随着新技术的不断发展与完善，以分子生物学技术为基础的分析检测方法迅速发展[8-9]。因此，建立一种快速简便的沙门氏菌检测方法具有重要意义。

等温扩增荧光技术是核酸等温扩增和荧光技术结合的新型核酸诊断POCT 技术，针对目的片段设计4 ～6 条特异引物。使用DNA 聚合酶，通过添加荧光染料实时监控整个扩增过程，分析实时扩增曲线和产物熔解曲线对产物进行定性或半定量。等温扩增荧光技术对温度精准度要求低，只需要恒定温度就能完成扩增反应，不需要预先进行双链DNA 的变性，大大缩短了反应时间。由于该方法具有操作简单、反应快速、灵敏度和特异性强等优势，已被广泛用于病原体的快速检测。

1 材料与方法

1.1 病原菌

沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌、恶臭假单胞菌（简称：SM、DC、JP、ZH、EC）由云南国际旅行卫生保健中心（昆明海关口岸门诊部）提供。

1.2 主要仪器

电泳仪、电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、OPG GENIE Ⅱ系统等温扩增荧光系统（OptiGene 公司）、恒温水浴锅、大龙移液器等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

采用菌液直接扩增法提取DNA，按1 ∶1 的比例加入裂解液与菌液混合，95 ℃水浴或金属浴加热5 min，备用。

1.3.2 引物的设计

利用美国NCBI 提供的BLAST 在线软件分析沙门氏菌中的SSAQ 基因目标序列，结合快速荧光PCR 法对目标片段的要求，筛选出长度为1 079 bp稳定的保守区域，作为引物设计的目标片段，并利用目标片段序列作为引物探针，针对保守区使用Lamp Designer 软件设计引物SM-1，其包括1 对内引物（FIP，BIP）和1 对外引物（F3，B3）。

1.3.3 等温扩增荧光法的建立

向扩增反应管中加入2.5 μL 沙门氏菌DNA，18.5 μL 反应液，4 μL 引物，阴性对照加2.5 μL ddH2O，混匀。用GENIE Ⅱ设置扩增程序65 ℃反应40 min，熔解程序98 ～80 ℃，0.05 ℃为1 个循环，根据扩增曲线和熔解曲线判定实验结果。

（1）特异性检测试验。用等温扩增荧光法对沙门氏菌和其他非沙门氏菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌和恶臭假单胞菌）菌株提取的DNA 分别进行扩增。

（2）灵敏度检测实验。将沙门氏菌核酸样本（初始浓度为528 ng·μL-1）10 倍比依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10浓度检测最低检测限。取八连管，每管分装18.5 μL Mix，4 μL 引物组，2.5 μL 样本，用ddH2O 作阴性对照。65 ℃反应40 min；熔解程序为98 ～80 ℃进行上机扩增。

1.3.4 常规PCR 检测沙门氏菌

（1）重复性实验。向扩增反应管中加入1 μL 沙门氏菌DNA（未稀释），12.5 μL 反应液，2 μL 引物（上游引物、下游引物各1 μL），9.5 μL ddH2O，混匀，设置一个空白对照，以ddH2O 代替，重复7 次，设置程序开始运行。完成电泳后，将凝胶块放置凝胶成像仪中，观察电泳条带。

（2）灵敏度检测实验。将沙门氏菌核酸样本（初始浓度为528 ng·μL-1）10 倍比依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6浓度检测最低检测限。设置一个原液浓度、一个空白对照，分别对扩增后不同浓度的沙门样本进行电泳分析，根据其条带的亮度和清晰度分析其最低检测限。

2 结果与分析

2.1 引物设计

引物设计完成后，使用BLAST 软件比对，结果发现，引物序列与沙门氏菌基因高度重合，且未匹配到其他病原的序列信息，初步证明SM-1 引物有比较高的特异性。

2.2 等温扩增荧光法

2.2.1 特异性检测试验

对沙门氏菌和其他4 种非沙门氏菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌和恶臭假单胞菌）同时进行检测，其结果只有沙门氏菌出现了特异性扩增，起峰时间在30 min 以内，将时间延长至1 h 后其他样本也未出现扩增，说明该试剂盒只针对沙门氏菌进行特异性检测。

2.2.2 灵敏性检测实验

由表1 可知，当样本检测浓度大于等于10-4时，本试验所建立的等温扩增荧光检测方法均能在30 min 内检出；当检测浓度低于10-4时未出现完整的扩增曲线，说明建立的等温扩增荧光技术能快速检测沙门氏菌的浓度为10-4，检测限为5.28×10-2ng·μL-1。

表1 灵敏度检测实验结果

2.3 常规PCR 检测沙门氏菌的结果

2.3.1 PCR 方法检测沙门氏菌的重复性

对沙门氏菌的DNA（未稀释）进行PCR 扩增，重复10 次，均可见清晰明显的288 bp 大小的条带，与预期结果吻合，说明该引物重复性好。

2.3.2 PCR 方法检测沙门氏菌的灵敏度

菌液稀释到10-3时候扩增效果不稳定，有微弱的条带但时常不会显现，因此判断10-2为常规PCR的最稳定的最低检测浓度，检测限为5.28 ng·μL-1，详见图1。与等温扩增荧光法相比，检测的灵敏度弱于等温扩增荧光法。

图1 沙门氏菌不同浓度电泳结果

3 结论与讨论

传统的沙门氏菌检测方法整个过程需4 ～5 d，且过程烦琐[10]。聚合酶链式反应在沙门氏菌诊断方法中具有较高的特异性和灵敏度，是沙门氏菌感染诊断中最具有应用前景的一种方法。然而，常规PCR 检测时间长，对反应环境要求较高，且检测仪器笨重。因此，建立一种反应快速、操作简单、特异性灵敏的方法至关重要。目前，等温扩增荧光法是一种能在恒定温度下进行体外核酸扩增的技术，已被广泛应用于医学病原物检测、食品安全检测和植物病原物的检测等方面[11]，有着极为广泛的应用前景。

本文测试了4 种非沙门氏菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌和恶臭假单胞菌），结果发现，本方法只对沙门氏菌的检测结果呈阳性，而对4 种非沙门氏菌的检测结果呈阴性，表明该方法特异性良好。同时梯度稀释方法进行沙门氏菌的灵敏度试验，并与常规PCR 检测方法进行了比较。结果表明，本试验建立的等温扩增荧光法检测沙门氏菌的灵敏度为5.28×10-2ng·μL-1，而常规PCR 的检测限为5.28 ng·μL-1，比常规PCR 灵敏100 倍。

等温扩增荧光法不需要反复变换温度，检测速度、易携性等方面比PCR 有很大的优势，有着操作简单、快速、敏感性和特异性好等特点，具有良好的发展前景，是病原检测的一项重要技术。