乳酸菌饮料活菌数符合度鉴定及温度对乳酸菌的影响

曹晓玉，王绪晶

（1.岳阳职业技术学院 生物环境工程学院，湖南岳阳 414000；2.浙鳌高级中学，浙江温州 325400）

随着人们对食品营养和功能性的需求越来越大，饮食习惯逐渐转向符合人们需求的食品——发酵食品。发酵食品主要包括由益生菌如乳杆菌属、双歧杆菌属和革兰氏阳性球菌等所发酵而成的食品[1]。大量研究表明，乳酸菌不仅能改善食品的风味，还具有调节机体胃肠道正常菌群[2]、保持微生态平衡[3]、降低血清胆固醇[4]等保健功能，被广泛应用于轻工业、乳制品、医药及饲料等行业中。

活性乳酸菌饮料作为一种含活乳酸菌的发酵乳饮料，因其可被益生菌当作优良载体，受到了消费者的喜爱。同时，如何保证乳酸菌饮料中活菌数含量成为相关人员的重点研究方向。孟令帅等[5]研究表明，酸奶在货架期内，pH 值下降，酸度上升，乳酸菌活菌数呈下降趋势，酸奶的整体感官评价下降。张岩等[6]研究发现在4 ℃条件下贮藏时，乳酸菌生长情况以及酸乳品质最佳，可有效延长酸乳货架期。本文从食品安全角度出发，以市售的4 种活性乳酸菌饮料为研究对象，测定其中的乳酸菌活菌数量，判断其在保质期内是否符合宣传内容，是否达到国家乳制品食品卫生安全标准。此外，通过比较冷藏温度和室温保存温度对乳酸菌活菌数的影响，评价不同品牌活性乳酸菌饮料的贮藏性差异以及为该类产品的贮藏及消费提供建议。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

乳酸菌饮料A、B、C 和D，市售。

蛋白胨、牛肉膏、酵母菌粉、醋酸钠（乙酸钠）、磷酸氢二钾、柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂、吐温-80 和葡萄糖。

洁净工作台（SW-CJ-2FD）、高压蒸汽灭菌锅（KG-SX-500）、恒温水浴培养箱（GHX-927OB）、冰箱（BCD-621WDCAU1）、数显pH 计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、天平、移液枪、平板、1.5 mL EP 管、无菌水、封口膜、250 mL 锥形瓶、1 L 烧杯、玻璃棒、1 L 量筒。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制

本实验主要采用乳酸菌专用培养基MRS，成分为蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母菌粉5 g、醋酸钠（乙酸钠）5 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸铵2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.2 g、琼脂20 g、吐温-80 1 mL、葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL 后，用冰乙酸调pH 值至6.2 ～6.6。因葡萄糖与蛋白胨发生反应，应先将葡萄糖配制成母液，分别灭菌后再按照比例加入。

1.2.2 实验操作方法

实验分别取不同品牌的活性乳酸菌饮料1 mL 进行梯度稀释，稀释倍数为100~108，每个稀释梯度做3 个平行，并将每个稀释梯度的3 个平行样涂布于已灭菌的MRS 固体培养皿上，在4 ℃恒温培养箱中培养，每24 h 观察一次菌落生长情况。

1.2.3 保藏温度为4 ℃时，不同品牌MRS 培养基中乳酸菌数目的测定

（1）乳酸菌的梯度稀释。在无菌操作台内，移液枪吸取1 mL 样品于1.5 mL 离心管中，此管为原液管。取8 个1.5 mL 离心管分别加入900 μL 无菌水，依次编号1、2、3、4、5、6、7、8 号管。从原液管中吸取100 μL 液体于1 号管，再从1 号吸取100 μL 液体置于2 号管，依次重复操作至8 号管，最终稀释为101~108倍。

（2）涂布。在无菌操作台内灼烧涂布棒，并冷却至室温。取一品牌不同梯度稀释菌液样品各100 μL，均匀涂布在已灭菌的MRS 固体培养基后并编号。设置平行对照组，其余3 个品牌操作相同。

（3）培养。将涂布完的培养基封口后倒置在恒温培养箱内，4 ℃培养72 h 后分别计数。

1.2.4 保藏温度为20 ℃时，不同品牌MRS 培养基中乳酸菌数目的测定

另购买的活性乳酸菌饮料放置在20 ℃培养箱中72 h，模拟室温保存乳酸菌饮料。

（1）乳酸菌的梯度稀释。在无菌操作台内，移液枪吸取1 mL 样品于1.5 mL 离心管中，此管为原液管。取8 个1.5 mL 离心管分别加入900 μL 无菌水，依次编号1、2、3、4、5、6、7、8 号管。从原液管中吸取100 μL 液体于1 号管，再从1 号吸取100 μL 液体置于2 号管，依次重复操作至8 号管，最终稀释为101~108倍。

（2）涂布。在无菌操作台内灼烧涂布棒，并冷却至室温。取一品牌不同梯度稀释菌液样品各100 μL，均匀涂布在已灭菌的MRS 固体培养基后并编号。设置平行对照组，其余3 个品牌操作相同。

（3）培养。将涂布完的培养基封口后倒置在恒温培养箱内，20 ℃培养72 h 后分别计数。

1.2.5 数据分析

乳酸菌数目的计算方法是用肉眼观察并计数。实验数据均以平均值和标准方差表示，采用Origin 2016 数据统计软件中的单因子方差分析（ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 不同梯度MRS 培养基乳酸菌培养情况

由图1 可知，乳酸菌菌落整体呈圆形，微白色，凸起，直径为（3±1） mm，湿润，边缘整齐。

图1 乳酸菌菌落形态

2.2 不同品牌乳酸菌活菌数检测结果

由表1 可知，A 品牌乳酸菌活菌实际测量数为16.2 亿个/mL，B 品牌乳酸菌活菌实际测量数为29.85 亿个/mL，C 品牌实际测量数为26.15 亿个/mL，D 品牌实际测量数为1.335 亿个/mL。实验所用的4 种市售活性乳酸菌饮料广告宣传活菌数均达到实际测量数，符合其宣传菌数要求，且实际测量数较广告宣传数大很多。分析其原因为厂家为保证广告乳酸菌数目在保质期内成立，厂家会在产品出厂时往产品中添加较多乳酸菌；厂家将广告宣传活菌数目降低，以达到通过检测的目的。

表1 4 种乳酸菌饮料广告宣传度和实验室实际测量数的对比结果

2.3 不同保藏温度对乳酸菌活菌数的影响

由图2 可知，在保藏温度为4 ℃时，4 种品牌饮料中B 品牌乳酸菌活菌数最多，且远大于D 品牌（P＜0.05），与其他品牌之间差异无统计学意义（P＞0.05）。在保藏温度为20 ℃时，4 种品牌乳饮料的乳酸菌活菌数均为0，无显著性差异（P＞0.05）。此外，相同品牌在不同保藏温度下的活菌数结果也略有不同。A、B、C 品牌的乳酸菌饮料在4 ℃保藏时，乳酸菌活菌数大于在20 ℃的培养结果（P＜0.05），但D 品牌在4 ℃保藏时的乳酸菌含量与20 ℃保藏并无太大差异（P＞0.05）。

图2 不同保藏温度对4 种品牌的乳酸菌活菌数的影响

由以上结果可知，在保藏温度为4 ℃时，D 品牌的乳酸菌数量虽然达到广告符合标准，但在所有品牌中乳酸菌活菌数最少，其他各品牌间乳酸菌活菌数从多到少分别是B、C、A。此外，20 ℃对于乳饮料中乳酸菌活菌数的影响很大，几乎没有活菌检出，建议消费者购买低温保藏产品，并在未饮用之前放置于低温冷藏。

3 结论与讨论

3.1 结论

本实验通过不同品牌活性乳酸菌饮料菌数符合度鉴定及不同温度对活菌数的影响，得出以下结论。①A、B、C 和D 品牌的活性乳酸菌饮料菌数达到均其宣传数，测量菌数分别为1.62×109个/mL、2.985×109个/mL、2.615×109个/mL 和1.335×108个/mL。②4 种品牌乳饮料中B 品牌乳酸菌含量最高，与D 品牌之间存在显著性差异（P＜0.05），与其他品牌之间差异无统计学意义（P＞0.05）。③在保藏温度为20 ℃时，4 种品牌乳饮料的乳酸菌含量均为0，无显著性差异（P＞0.05）。④活性乳酸菌饮料应当放置在4 ℃左右条件下贮藏，室温会影响其乳酸菌活性和含量。

3.2 讨论

实验选取的4 种市售活性乳酸菌饮料菌数均达到其宣传数。董庆利等[7]对市场乳酸菌饮料的抽检结果表明，两种乳酸菌饮料在冷藏温度下，乳酸菌数显著下降，但仍在其宣传范围内。本实验结果与董庆利等结论相对比发现，乳制品市场已经趋于规范，并未存在虚假宣传的现象。

此外，本实验比较了温度对乳酸菌数的影响。当不同品牌在温度为4 ℃保藏时，A、B、C 培养结果之间差异无统计学意义，且检测出的活菌数量未低于广告宣传数。当不同品牌在20 ℃下保藏时，所有样品中乳酸菌均未检出，说明20 ℃对于乳饮料中乳酸菌含量影响很大，与张岩等[6]实验关于酸乳在4 ℃条件下贮藏时，乳酸菌生长情况以及酸乳品质最佳，可有效延长酸乳货架期的结果相同。在4 ℃保藏时，A、B、C 品牌的乳酸菌含量大于20 ℃的活菌数（P＜0.05），但D 品牌4 ℃保藏时乳酸菌含量与20 ℃保藏并无太大差异（P＞0.05）。综上所述，所有活性乳酸菌饮料均应当放置在4 ℃条件下贮藏，20 ℃（室温）会影响其乳酸菌活性和含量，从而导致活性乳酸菌饮料的营养价值降低。建议消费者购买时，挑选在保质期内的低温保藏产品，并在未饮用前放置于低温冷藏。