1株巨大芽孢杆菌BM05发酵条件的优化

刘 露，边巴穷达，闫洪雪，张鹏鹏，梁文辉，李 丽，赵宏涛

(1.海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400；2.西藏自治区日喀则市桑珠孜区农牧局，西藏日喀则 857000；3.青岛明月蓝海生物科技有限公司，山东青岛 266400)



1株巨大芽孢杆菌BM05发酵条件的优化

刘 露1，边巴穷达2，闫洪雪1，张鹏鹏1，梁文辉3，李 丽1，赵宏涛3

(1.海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400；2.西藏自治区日喀则市桑珠孜区农牧局，西藏日喀则 857000；3.青岛明月蓝海生物科技有限公司，山东青岛 266400)

[目的]优化巨大芽孢杆菌BM05的发酵条件，提高其发酵活菌数。[方法]通过单因素试验筛选最佳碳、氮源，通过正交试验筛选最佳C/N比，并研究pH、发酵温度、接种量和转速对发酵的影响。[结果]碳源选用玉米淀粉和葡萄糖，氮源选择牛肉粉，初始pH 7.0，发酵温度35 ℃，接种量为4%，转速220 r/min为最佳发酵条件。通过发酵条件优化，发酵菌数达4.73×109cfu/mL，比原始配方提高了1.56倍。[结论]优化后的发酵条件大大提高了巨大芽孢杆菌BM05的发酵活菌数。

巨大芽孢杆菌; 配方优化；正交试验

解磷微生物可将土壤中的难溶性磷酸盐转化为植物可吸收的物质[1]，从而促进作物生长发育。巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)是农业上常用的解磷微生物，俗称“大芽孢”磷细菌[2]，具有显著的解磷功效[3]，是生产生物有机肥和微生物菌剂的常用菌种[4]。巨大芽孢杆菌BM05具有解磷作用，笔者通过单因素试验和正交试验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行了优化，以期提高巨大芽孢杆菌BM05的发酵活菌数，同时降低生产成本。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。巨大芽孢杆菌BM05由海藻活性物质国家重点实验室保藏。

1.1.2仪器。SW-CJ-2F型超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)、YXQ-LS-70A型高压蒸汽灭菌锅(江苏太仓市试验设备厂)、THZ-D型摇床(江苏太仓市实验设备厂)和LRH-150B型培养箱(广东韶关市泰宏医疗器械有限公司)。

1.1.3培养基。种子培养基：酵母粉6.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0。原始发酵培养基：麦芽糊精 10.0 g/L，豆饼粉10.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO40.2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO31.0 g/L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1不同碳源对菌数的影响试验。选用不同的碳源：麦芽糊精、糖蜜液、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉和玉米粉，浓度均为10.0 g/L，配方中其他成分同原始发酵培养基。接种量为2%，250 mL摇瓶装液量为50 mL，摇床32 ℃、180 r/min振荡培养，完全转芽孢后利用涂平板计数法[5]测定发酵液中菌数，比较不同碳源对发酵活菌数的影响。

1.2.2不同氮源对菌数的影响试验。选用不同的氮源：豆饼粉、蛋白胨、脱脂豆粉、酵母粉、牛肉粉和玉米浆，浓度均为10.0 g/L，配方中其他成分同原始发酵培养基。培养条件不变。利用涂平板计数法测定发酵液中菌数，比较不同氮源对发酵液中菌数的影响。

1.2.3不同C/N比对菌数的影响试验。以玉米淀粉、葡萄糖和牛肉粉作为因素，每个因素设3个水平，利用SPSS17.0软件设计试验，进一步优化发酵培养基中碳、氮源的浓度。培养基的其他成分同原始发酵培养基，培养条件不变。

1.2.4初始pH对菌数的影响试验。选择初始pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，其他发酵条件为：温度32 ℃，接种量2%，转速180 r/min。

1.2.5发酵温度对菌数的影响试验。发酵温度选择27、29、31、33、35、37和39 ℃，初始pH 7.0，接种量为2%，转速180 r/min。

1.2.6接种量对菌数的影响试验。接种量选择2%、4%、6%、8%和10%，发酵温度为35 ℃，初始pH 7.0，转速为180 r/min。

1.2.7转速对菌数的影响试验。转速选择140、160、180、200、220和240 r/min，接种量为4%，发酵温度为35 ℃，初始pH 7.0。

1.2.8新配方在发酵罐上的稳定性考察。分别将原始配方、最优配方及发酵条件在10 L发酵罐中(装液量为6 L)进行生产水平评估，设3次重复试验，考察优化配方的稳定性。

2　结果与分析

2.1不同碳源对菌数的影响由图1可知，以玉米淀粉为碳源时，菌数明显比其他碳源高，所以选择玉米淀粉为碳源。

图1　不同碳源对菌数的影响Fig.1　Effects of carbon sources on the bacterial count

2.2不同氮源对菌数的影响由图2可知，以牛肉粉为氮源时，菌数明显比其他氮源高，所以选择牛肉粉为氮源。

图2　不同氮源对菌数的影响Fig.2　Effects of nitrogen sources on the bacterial count

2.3不同C/N比对菌数的影响由表1、2可知，各因子对活菌数的影响大小顺序为牛肉粉、葡萄糖、玉米淀粉。最佳培养基组分为玉米淀粉10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，牛肉粉15.0 g/L。

表1不同C/N比对菌数影响的正交试验设计及结果

Table 1Design of orthogonal test on effects of C/N ratio on the bacterial count

处理Treat-ment因素Factor玉米淀粉Cornstarchg/L葡萄糖Glucoseg/L牛肉粉Beefpowderg/L菌数Bacterialcount×108cfu/mL120610172105202632042029410615375156202862051536715510218154153391041018

2.4初始pH对菌数的影响由图3可知，随着pH的增加，菌数呈先增加后降低的趋势；当pH为7.0时，巨大芽孢杆菌BM05芽孢整齐且菌数最高。

表2不同C/N比对菌数影响的正交试验结果

Table 2Result of orthogonal test on effects of C/N ratio on the bacterial count

因素Factor均方MeansquareF值FvalueP>F玉米淀粉Cornstarch0.1110.0110.989葡萄糖Glucose0.7780.0770.929牛肉粉Beefpowder208.77820.6480.046

图3　不同pH对菌数的影响Fig.3　Effects of pH value on the bacterial count

2.5发酵温度对菌数的影响由图4可知，随着温度升高，菌数呈先增加后降低的趋势；当温度为35 ℃时，菌数最高。

图4　不同温度对菌数的影响Fig.4　Effects of temperature on the bacterial count

2.6接种量对菌数的影响由图5可知，当接种量为2%时，发酵时延迟期时间较长，且总发酵时间长；当接种量为4%时，芽孢整齐，发酵菌数最高，接种量越高，延迟期越短，但发酵菌数越低，所以选择接种量为4%。

图5　不同接种量对菌数的影响Fig.5　Effects of inoculum size on the bacterial count

2.7转速对菌数的影响由图6可知，当转速为220 r/min时，发酵活菌数最高，所以最佳发酵转速设为220 r/min。

图6　不同转速对菌数的影响Fig.6　Effects of rotation speed on the bacterial count

2.8新配方在发酵罐上的稳定性通过上述试验，最优配方为：玉米淀粉10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，牛肉粉15.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO40.2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO31.0 g/L，pH 7.0。发酵条件为：发酵温度35 ℃，接种量4%，转速220 r/min。

将原始配方和新配方分别在10 L发酵罐上发酵。原始配方发酵30 h转芽孢，芽孢率达90%，菌数为1.85×109cfu/mL；新配方进行3次发酵试验，发酵稳定，发酵28 h转芽孢，芽孢率在95%以上，菌数为4.73×109cfu/mL，提高了1.56倍。

3　结论与讨论

试验结果表明，巨大芽孢杆菌BM05的最优发酵配方为：玉米淀粉10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，牛肉粉15.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO40.2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO31.0 g/L。发酵起始pH为7.0，发酵温度35 ℃，接种量4%，转速220 r/min。通过发酵罐试验，发酵菌数从原始配方的1.85×109cfu/mL提高到4.73×109cfu/mL，提高了1.56倍。

巨大芽孢杆菌BM05配方中采用2种碳源和2种氮源共用的形式，葡萄糖和硫酸铵可缩短延迟期，玉米淀粉和牛肉粉的加入可供后期菌的生长繁殖，且成本较低，通过正交试验合理了碳氮的比例，达到使BM05生长的最优水平。

对巨大芽孢杆菌发酵条件的优化，李丽等[6]采用测OD的方式检测菌生长量，该研究直接采用测活菌数，结果更准确。通过配方优化，发酵活菌数明显高于其他巨大芽孢杆菌[7-9]，为巨大芽孢杆菌菌肥的工厂化生产提供了基础数据。

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[5] 沈萍，陈向东.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2010：28-34.

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Optimization of Fermentation Condition ofBacillusmegateriumBM05

LIU Lu1, Penpa Chungdak2, YAN Hong-xue1et al

(1.State Key Laboratory of Bioactive Seaweed Substances, Qingdao, Shandong 266400; 2. Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Shigatse Sangzhuzi Area in Tibet Autonomous Region, Shigatse, Tibet 857000)

[Objective] To optimize the fermentation condition ofBacillusmegateriumBM05, and to enhance the fermented bacterial count. [Method] The optimal carbon source and nitrogen source were selected by single factor test, while the optimal carbon-nitrogen ratio was selected by orthogonal test. And the pH, fermentation temperature, inoculation quantity and rotation speed were also studied. [Result] Corn starch and glucose were the optimal carbon source and beef powder was the optimal nitrogen source. The optimal fermentation conditions were initial pH 7.0, 35 ℃ temperature, 4% inoculation quantity and 220 r/min rotation speed.BacillusmegateriumBM05 reached 4.73×109cfu/mL after the optimization of fermentation condition, which was 1.56 times higher than the control. [Conclusion] The optimized fermentation condition greatly enhances the fermented bacterial count ofBacillusmegateriumBM05.

Bacillusmegaterium; Formulation optimization; Orthogonal test

刘露(1987- )，女，山东济南人，工程师，硕士，从事微生物应用研究。

2016-05-31

Q 939.96

A

0517-6611(2016)21-024-03