培养温度、时间对饲用凝结芽孢杆菌菌数的影响

■ 王雪艳 王乙茹 黄遵锡 陈德近 何 雪 安清聪 程志斌*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.达州职业技术学院，四川达州 635001；3.云南师范大学生命科学学院，云南昆明 650222；4.爱科特生物工程(昆明)有限公司，云南昆明 650506）

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），是芽孢杆菌属、乳酸菌类益生菌[1-3]。很多研究表明，饲用凝结芽孢杆菌改善畜禽生产性能的作用效果具有明显的剂量效应，即与饲粮中凝结芽孢杆菌的添加菌数相关[4-8]。因此，饲用凝结芽孢杆菌制剂的菌数检测真实性和准确性，备受生产企业及应用企业的关注[9]。当前，我国饲用凝结芽孢杆菌制剂的菌数检测方法标准主要有《饲料添加剂 凝结芽孢杆菌的测定（T/YNBX 024—2021）》（云南省标准化协会颁布，简称“云南团标”）[10]、《饲料添加剂 凝结芽孢杆菌（T/CSWSL 022—2020）》（北京生物饲料产业技术创新战略联盟颁布，简称“北京团标”）[11]，对菌数检测均采用了平板计数法，其检测原理是将凝结芽孢杆菌接种到特定培养基，在最佳的培养温度、培养时间观测培养基上单个菌体细胞长成的菌落[9]，并以特征菌落数量、个体大小、分散程度等指标进行平板计数[12]。由此可见，培养温度、培养时间是准确检测饲用凝结芽孢杆菌菌数的关键。

然而，云南团标采用的培养条件为“低温长时间”（40 ℃/48 h）[10]，北京团标采用的培养条件为“高温短时间”（50 ℃/24 h）[11]，以上2 个标准中培养条件的较大差异不利于生产企业及应用企业判定饲用凝结芽孢杆菌制剂的质量[9]。据此，本试验研究了培养温度、培养时间对凝结芽孢杆菌菌数检测结果的影响，为进一步规范饲用凝结芽孢杆菌制剂菌数检测方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料鉴定及制备

饲用凝结芽孢杆菌制剂（购买原粉标识500 亿CFU/g）由爱科特生物工程（昆明）有限公司提供。样品涂板培养，观察菌落形态。然后，挑取单菌落用改良MRS 培养基扩培[13-14]，经16S rRNA 基因测序及比对，确定为凝结芽孢杆菌。

随后，将原粉（A 样品）用淀粉稀释5 倍（B 样品）、25倍（C样品），制备成3个样品，用于本次方法学研究。

1.2 培养基

云南团标培养基成分：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、牛肉膏5.0 g、葡萄糖5.0 g（无需分开灭菌）、番茄粉0.5 g、氯化钠2.5 g、无水氯化钙0.15 g、水合硫酸锰0.1 g、琼脂粉25.0 g、蒸馏水1 000 mL、配置好后调节pH为5.2[10]。

北京团标培养基成分：大豆蛋白胨5.0 g、酵母粉2.0 g、L-半胱氨酸0.25 g、葡萄糖5.0 g、乙酸钠2.5 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸锰0.1 g、硫酸镁0.025 g、溴甲酚紫0.032 g、琼脂粉20.0 g、蒸馏水1 000 mL 配置好后调节pH为5.5[11]。

1.3 试验设计

基于云南团标[10]、北京团标[11]中凝结芽孢杆菌菌数检测的培养温度、培养时间差异，试验设计如下：

云南团标检测试验的4 个培养条件处理组为：TC40℃/24h组（40 ℃/24 h 低温、短时培养）、TC40℃/48h组（40 ℃/48 h 低温、长时培养）、TC50℃/24h组（50 ℃/24 h高温、短时培养）、TC50℃/48h组（50 ℃/48 h 高温、长时培养）。

北京团标检测试验的4 个培养条件处理组为SC40℃/24h组（40 ℃/24 h 低温、短时培养）、SC40℃/48h组（40 ℃/48 h 低温、长时培养）、SC50℃/24h组（50 ℃/24 h高温、短时培养）、SC50℃/48h组（50 ℃/48 h 高温、长时培养）。

用平板计数法开展8 个处理组、3 个样品的菌数检测，并进行菌数比较分析。

1.4 检测步骤

1.4.1 取样及样品菌悬液制备

3个样品各精确称取1.000 g，分别转入装有100 mL稀释液的锥形瓶（锥形瓶及内置的5 mm 玻璃珠，已灭菌处理），置于摇床震荡30 min，制备成10-2的样品菌悬液。

1.4.2 梯度稀释

吸取样品菌悬液0.8 mL 至装有7.2 mL 稀释液的EP 管中稀释，并重复这一操作3～7 次，进行逐级梯度稀释，至3 个样品的检测“所需稀释度”（平板上30～300个可计数菌落）[9]，样品A、B、C稀释度分别为10-8、10-7、10-6。

1.4.3 培养与计数

1.4.3.1 培养

① 云南团体标准检测（T/YNBX 024—2021）

从“所需稀释度”菌悬液的EP 管吸取100 μL，用涂布器在培养基平板上均匀涂布，所用培养基参考云南团体标准。按“所需稀释度”的菌液，涂布6 个平板。从6 个平板中随机取3 个平板，于40 ℃培养24 h后检测菌数，记录为“TC40℃/24h”组的菌数；随后，在40 ℃延长培养至48 h，记录为“TC40℃/48h”组的菌数。

余下3 个平板于50 ℃培养24 h 后检测菌数，记录为“TC50℃/24h”组的菌数；随后，在50 ℃延长培养至48 h，记录为“TC50℃/48h”组的菌数。

② 北京团体标准检测（T/CSWSL 022—2020）

按照北京团体标准的检测步骤，将“所需稀释度”菌悬液的EP 管放于80 ℃水浴处理10 min 后，再进行菌数检测[9]。

从热处理后的EP 管中吸取100 μL 菌悬液，用涂布器在培养基平板上均匀涂布，所用培养基参考北京团体标准。按“所需稀释度”的菌液，涂布6 个平板。从6个平板中随机取3个平板，于40 ℃培养24 h后检测菌数，记录为“SC40℃/24h”组的菌数；随后，在40 ℃延长培养至48 h，记录为“SC40℃/48h”组的菌数。

余下3 个平板于50 ℃培养24 h 后检测菌数，记录为“SC50℃/24h”组的菌数；随后，在50 ℃延长培养至48 h，记录为“SC50℃/48h”组的菌数。

1.4.3.2 计数

菌数计数参照云南团标中“6.3.3.1 活菌含量计算式”进行[10]。

1.5 统计分析

菌数检测值用“平均值±标准差”表示，并进行单因素方差分析。用SPSS 21.0 统计软件分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 样品菌株鉴定

样品菌落形态见图1（A），16S rRNA 测序所得菌株的基因序列在NCBI 中经Blast 比对，与Weizmannia coagulansMT604642 相似度高达99.93%。2022 年8月，国家卫健委第4 号公告，依据国际微生物菌株的重新命名，已经将凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）更名为凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），并在我国设置两年过渡期。基因序列构建的发育树见图1（B），序列与凝结芽孢杆菌聚为一簇，鉴定该样品菌株为凝结芽孢杆菌。

2.2 云南团标检测步骤的培养温度、时间对饲用凝结芽孢杆菌菌数的影响

云南团体标准检测3个样品中凝结芽孢杆菌菌数的结果见表1，3个样品的TC50℃/24h（50 ℃/24 h培养）组菌数与TC50℃/48h（50 ℃/48 h培养）组完全一致，均显著高于TC40℃/48h（40 ℃/48 h 培养）组（P＜0.05)，图2 显示，TC50℃/24h平 板 菌 落 比TC40℃/48h密 集，且 同 一 视 野 下TC50℃/48h组平板上的菌落明显大于培养时间较短的TC50℃/24h组。此外，表1和图2显示TC40℃/24h（40 ℃/24 h培养）组平板上无菌落生长，因此无菌数计数数据。

表1 培养温度、时间对凝结芽孢杆菌菌数的影响（云南团标检测步骤，亿CFU/g)

图2 培养温度、时间对凝结芽孢杆菌菌数的影响（菌落形态，云南团标检测）

2.3 北京团标检测步骤的培养温度、时间对饲用凝结芽孢杆菌菌数的影响

北京团体标准检测3 个样品中凝结芽孢杆菌菌数的结果如下见表2，3 个样品的SC50℃/24h（50 ℃/24 h培养）组菌数与SC50℃/48h（50 ℃/48 h 培养）完全一致，均显著高于SC40℃/48h（40 ℃/48 h 培养）组（P＜0.05）。如图3所示，北京团体标准的平板培养基为浅黄绿色，与云南团体标准的平板培养基明显不同，且SC50℃/24h组平板菌落比SC40℃/48h组密集；同一视野下SC50℃/48h组平板上的菌落明显大于培养时间较短的SC50℃/24h组。此外，表2 和图3 显示SC40℃/24h（40 ℃/24 h 培养）组平板上无菌落生长，因此无菌数计数数据。

表2 培养温度、时间对凝结芽孢杆菌菌数的影响（北京团标检测步骤，亿CFU/g）

图3 培养温度、时间对凝结芽孢杆菌菌数的影响（菌落形态，北京团标检测）

2.4 云南团体标准与北京团体标准检测凝结芽孢杆菌菌数的比较

由表3 可知，在50 ℃培养24 h 或48 h，TC50℃/24h组样品B 和样品C 菌数均显著高于SC50℃/24h组（P＜0.05）。此外，TC40℃/48h组的样品A 和样品C 菌数均显著高于SC40℃/48h组（P＜0.05）。

表3 云南团标与北京团标检测凝结芽孢杆菌菌数的比较

3 讨论

众所周知，适宜的温度、水分、营养等是细菌繁殖与生长的基本条件，因此最佳的培养温度与培养时间成为细菌菌数平板计数法的关键条件[9]。基于云南团标“低温、长时”（40 ℃/48 h）与北京团标“高温、短时”（50 ℃/24 h）的培养条件差异，本研究设置了“低温、长时”（40 ℃/48 h）、“低温、短时”（40 ℃/24 h）、“高温、长时”（50 ℃/48 h）、“高温、短时”（50 ℃/24 h）四个培养条件，分别按云南团标、北京团标的检测步骤，对不同含量的3 个饲用凝结芽孢杆菌制剂样品进行了平板计数研究。数据显示，50 ℃/24 h 培养的凝结芽孢杆菌菌数显著高于40 ℃/48 h 培养的菌数（TC50℃/24h＞TC40℃/48h；SC50℃/24h＞SC40℃/48h），且40 ℃/24 h 培养的平板上(TC40℃/24h和SC40℃/24h)无菌落生长，无法检测计数。进一步观察平板上凝结芽孢杆菌的菌落数量、个体大小、分散程度，发现无论采用云南团标操作步骤还是北京团标操作步骤，50 ℃/24 h 培养得检出菌数与50 ℃/48 h 培养的完全一致，区别在于同一视野下观察50 ℃/48 h 培养的菌落个体明显大于50 ℃/24 h的菌落。以上结果表明，平板计数法检测饲用凝结芽孢杆菌菌数的适宜培养温度为50 ℃、培养时间为24～48 h。

此外，表3 结果显示50 ℃/24 h 或50 ℃/48 h 培养条件下，3 个凝结芽孢杆菌样品采用云南团标操作的检出菌数比北京团标的检出菌数高7.89%～8.14%，且B、C 组整体差异显著。原因分析如下：其一，总菌数（total aerobic count, TC）与芽孢数（spore count, SC）的检测差异。凝结芽孢杆菌为芽孢杆菌属益生菌，因此饲用凝结芽孢杆菌制剂中普遍存在芽孢、活菌等多种状态的细菌[1，9，17]。北京团标的检测步骤将样品80 ℃/10 min 热处理后进行菌数检测[11]，而云南团标检测步骤未对样品热处理[10]。董佩佩等[16]、严涛等[17]、单春乔等[18]认为80 ℃/10 min 热处理是芽孢杆菌属益生菌制剂中芽孢数检测的规范方法，因为有效去除了制剂中的活菌《饲料中饲用芽孢杆菌的测定（DB 32/T 2583—2013）》[19]。据此，北京团标实测的是饲用凝结芽孢杆菌制剂的芽孢数，而云南团标实测的是饲用凝结芽孢杆菌制剂的总菌数（包括芽孢和活菌），两者在概念及检出值上有明显区别和差异[9]。其二，培养基差异。有综述文章显示[9]，云南团标培养基与北京团标培养基的营养组分及含量有明显差异，而营养底物是影响细菌生长的重要条件[20-21]，因此可能影响菌数检出结果，这也在本试验图2、图3 的培养基颜色、菌落大小等差异上直观印证。诚然，这一推测有待进一步试验的科学数据验证。

4 结论

研究证明，平板计数法检测饲用凝结芽孢杆菌菌数的适宜培养温度为50 ℃、培养时间为24～48 h。此外，通过对比检出菌数，分析出北京团标实测的是饲用凝结芽孢杆菌制剂的芽孢数，而云南团标实测了饲用凝结芽孢杆菌制剂的总菌数。本研究为规范饲用凝结芽孢杆菌菌数平板计数法的操作提供科学依据，为饲用凝结芽孢杆菌制剂生产企业及应用企业的产品质检提供借鉴。