凤丹皮内生真菌Alternaria arborescens发酵产物中甾醇类化合物

翟晓东，孙磊，吴德玲，许凤清（安徽中医药大学药学院 中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，合肥 230012）

牡丹皮Cortex Moutan始载于《神农本草经》，性微寒，味苦，辛，为清热凉血、活血化瘀之要药。安徽省铜陵市自晋代就有栽培牡丹的记载，距今已有1700多年的历史，其中凤凰山所出者因皮厚、木心小、香气足、疗效好享有道地药材之美誉。道地药材是植物基因组、植物外环境（土壤、气候、生物等因素）以及植物内环境（内生菌群、pH等）相互作用的产物[1]。内生真菌（endophytic fungi）是指生活在宿主植物组织中，与宿主植物共生时期对宿主植物组织没有引起明显病害症状并与宿主植物共生互惠的真菌[2]。其对宿主的促生长、抗逆性、促进活性物质生成和积累、吸附重金属等功能是道地药材形成的重要因子[3-4]。本实验前期对凤丹皮不同生长期内生真菌多样性研究中，分离并鉴定了9属13种内生真菌，并运用生物发酵工程研究分离纯化得到的Aspergillus sp. MBL1612、Fusarium oxysporum和Fusarium acutatum等菌株的次生代谢产物[5-8]。本文报道来源于凤丹皮中的一株优势菌株Alternaria arborescens，经液体发酵产生的麦角甾醇类成分的分离和结构鉴定工作。

1 材料

1.1 仪器与试药

捷欧路JNM-ECP 600 MHz型核磁共振波谱仪（日本电子株式会社）；Agilent 1260 Infinity 2液相色谱系统（Agilent公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）；万分之一电子天平（EL104型）；低温冰箱50 L（海信集团有限公司）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；YMC-Pack ODS-A色谱柱（粒径：5 μm，孔径：12 nm；250 mm×10.0 mm）；Sephadex LH-20（GE公司）；柱色谱硅胶（200～300目）、薄层色谱用硅胶板（GF254）（青岛海洋化工厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，TEDIA公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；显色剂为10%硫酸-乙醇溶液（105℃加热显色）。

1.2 菌株来源及鉴定

新鲜凤丹皮块根于2017年采集安徽省铜陵市凤凰山铁山村凤丹种植基地，经安徽中医药大学方成武教授鉴定为芍药科芍药属Paeonia ostiiT. Hong et J. X. Zhang的新鲜植株。按文献[9]进行分离纯化，经上海生工生物工程有限公司进行分子鉴定。大致流程为：纯化的菌株经PDA平板培养5 d，依据《真菌鉴定手册》对真菌菌落、培养特征、菌丝形态、产孢结构类型以及孢子的形态、颜色、大小进行初步鉴定分类；同时将菌丝置于无菌研钵中研磨（液氮），参照试剂盒步骤进行操作提取DNA，进行rDNA-ITS的PCR扩增[上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3']，将PCR扩增产物交由海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果与GenBank 数据库中的已知序列进行 NCBI BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对分析，寻找具有较高同源性的16S rDNA 序列，经基因测序对比后鉴定为Alternaria arborescens（GenBank：AF347033），现保存于安徽中医药大学天然药物化学研究室（样本凭证号m 26）。

1.3 培养基

PDA培养基：每500 mL培养基中含去皮马铃薯100 g、磷酸二氢钾1.5 g、蛋白胨0.5 g、葡萄糖10 g、维生素B 55 mg、硫酸镁0.75 g，最后加入氢氧化钠，调节pH值至5.5～6.0。每500 mL加3.0 g琼脂粉。将PDA培养基放入500 mL锥形瓶中，用铝箔封口，高压灭菌30 min，趁热导入已灭菌的冷却干燥培养皿中，凝固冷却，备用。大米固体培养基：取100 g大米，120 mL超纯水于500 mL锥形瓶中，封口。放入高压蒸汽灭菌锅120℃灭菌30 min，备用。

2 发酵、提取与分离

2.1 液体发酵

将保存于－18℃冰箱的斜面培养基的Alternaria arborescens接种于PDA平板，在恒温培养箱中28℃培养6 d，待菌种长至约2/3平板，观察菌落形态，挑选无污染长势良好的平板，用接种环挑取菌落周围新长出的菌丝，接种于多个PDA平板中，培养8 d待菌种铺满整个平板时，将其用打孔器制成约6 mm的圆片，接种于已灭菌的液体培养基中，设置温度28℃，转速150 r·min－1的全温振荡培养箱中培养15 d。共培养120瓶。

2.2 发酵产物的提取与分离

将内生真菌Alternaria arborescens的发酵产物过滤，得到菌丝体和发酵液。将过滤得到的菌丝置于三角烧瓶中，加乙醇35℃超声提取30 min 3次，过滤，收集浸提液，减压浓缩至无醇，混入发酵液中，浓缩至500 mL。乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，得到浸膏乙酸乙酯部位（16.8 g）。取乙酸乙酯萃取部位16.0 g，经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯比例为39∶1、19∶1、9∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、0∶100，每200 mL一个流分，各2 L）洗脱，经TLC检识合并得到8个流分Fr.1～Fr.8。流分Fr.2经硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯（9∶1）洗脱，重结晶得到化合物6（118 mg）。流分Fr.3通过硅胶柱（石油醚-丙酮比例为9∶1、4∶1、1∶1、0∶100）洗脱，使用TLC检识合并得到5个流分Fr.3.1～Fr.3.5。将Fr.3.2部位（250 mg）经制备液相（甲醇-水＝98∶2，流速3 mL·min－1，检测波长210 nm）得到化合物2（16 mg，tR＝22.5 min）和5（9 mg，tR＝18.3 min）。流分Fr.3.3（450 mg）依次经Sephadex LH-20柱色谱（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）、制备液相（甲醇-水＝95∶5，流速3 mL·min－1，检测波长210 nm，tR＝8.5 min）得到化合物1。将流分Fr.4经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯的比例为7∶1、4∶1、1∶1、0∶100）洗脱，经TLC检识合并得到4个流分Fr.4.1～Fr.4.4。流分Fr.4.3依次经Sephadex LH-20柱色谱（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）、制备液相（甲醇-水＝90∶10，流速3 mL·min－1，检测波长210 nm，tR＝32 min）得到化合物3（4 mg）。流分Fr.5经Sephadex LH-20柱色谱（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）、制备液相（甲醇-水＝100∶0，流速3 mL·min－1，检测波长210 nm，tR＝10.5 min）得到化合物4（10 mg），化合物结构见图1。

图1 化合物1～6的结构式Fig 1 Chemical structure of compound 1～6

3 结构鉴定

化合物1白色针状结晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇显色为紫红色。ESI-MSm/z：431.3[M＋Na]＋；1H NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.33（1H，dt，J＝7.2、2.4 Hz，H-7），5.20（1H，dd，J＝15.0、7.2 Hz，H-23），5.13（1H，dd，J＝15.0、8.4 Hz，H-22），4.04（1H，m，H-3），3.61（1H，br s，H-6），2.11（1H，t，J＝12.0 Hz，H-4a），2.03（1H，dt，J＝12.0、4.2 Hz，H-12a），2.00（1H，m，H-20），1.83（2H，m，H-15），1.95（1H，m，H-9），1.88（1H，m，H-14），1.83（1H，m，H-24），1.75（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-4b），1.71、1.26（1H each，m，H-15），1.60、1.53（1H each，m，H-1），1.54（2H，m，H-11），1.46（1H，m，H-25），1.41（2H，m，H-16），1.30（1H，m，H-12b），1.28（1H，m，H-17），1.07（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.90（3H，d，J＝7.8 Hz，H-28），0.82（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.80（3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.59（3H，s，H-18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：144.10（s，C-8），135.44（d，C-22），132.26（d，C-23），117.62（d，C-7），76.03（s，C-5），73.75（d，C-6），67.81（d，C-3），56.07（d，C-17），54.83（d，C-14），43.84（s，C-13），43.56（d，C-9），42.89（d，C-24），40.47（d，C-20），39.55（t，C-4），39.30（t，C-12），37.22（s，C-10），33.15（d，C-25），33.05（t，C-1），30.94（t，C-2），27.98（t，C-16），22.96（t，C-15），22.13（t，C-11），21.19（q，C-21），20.02（q，C-27），19.72（q，C-26），18.92（q，C-19），17.66（q，C-28），12.41（q，C-18）。以上数据与文献[10]报道一致，故化合物1 鉴定为（22E，24R）-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇。

化合物 2白色针状结晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇显色为紫红色。ESI-MSm/z：396.3 [M＋H]＋；1H NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.57（1H，d，J＝4.4 Hz，H-6），5.38（1H，d，J＝4.4 Hz，H-7），5.20（1H，dd，J＝15.2、7.2 Hz，H-23），5.14（1H，dd，J＝15.2、7.2 Hz，H-22），3.61（1H，m，H-3），1.03（3H，d，J＝6.4 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-19），0.91（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.85（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.82（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26），0.63（3H，s，H-18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：141.45（s，C-8），139.86（s，C-5），135.64（d，C-22），132.06（d，C-23），119.67（d，C-6），116.36（d，C-7），70.55（d，C-3），55.82（d，C-17），54.64（d，C-14），46.33（d，C-9），42.92（d，C-24），42.90（s，C-13），40.88（t，C-4），40.49（d，C-20），39.16（t，C-12），38.45（t，C-1），37.11（s，C-10），33.17（d，C-25），32.08（t，C-2），28.36（t，C-16），23.07（t，C-15），21.19（t，C-11），21.18（q，C-21），20.03（q，C-27），19.72（q，C-26），17.68（q，C-28），16.35（q，C-19），12.13（q，C-18）。以上数据与文献[11]报道一致，故化合物2鉴定为麦角甾醇。

化合物3白色针状结晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇显色为紫红色。ESI-MSm/z：429.3 [M＋H]＋；1H NMR（MeOD，600 MHz）δ：6.52（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），5.27（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），5.22（1H，dd，J＝15.6、7.6 Hz，H-23），5.17（1H，dd，J＝15.6、6.8 Hz，H-22），3.77（1H，m，H-3），1.01（3H，d，J＝6.4 Hz，H-21），0.92（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.90（3H，s，H-19），0.85（3H，s，H-18），0.85（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.83（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26）；13C NMR（MeOD，150 MHz）δ：136.90（d，C-6），136.90（d，C-22），133.56（d，C-23），131.81（d，C-7），83.57（s，C-5），80.84（s，C-8），67.08（d，C-3），57.67（d，C-17），53.20（d，C-14），52.85（d，C-9），45.85（d，C-24），44.41（t，C-4），41.19（s，C-13），40.77（d，C-20），38.25（t，C-12），37.86（s，C-10），36.00（d，C-25），34.45（t，C-2），30.96（t，C-1），29.87（t，C-16），24.49（t，C-15），21.85（t，C-11），21.47（q，C-21），20.03（q，C-27），20.17（q，C-26），18.58（q，C-28），18.26（q，C-19），13.37（q，C-18）。以上数据与文献[10-12]报道一致，故化合物3鉴定为5α，8α-环氧-（22E，24R）麦角甾-6，22-二烯-3β-醇。

化合物4白色针状结晶（二氯甲烷∶甲醇＝1∶1），10%硫酸乙醇显色为紫红色。ESI-MSm/z：427.3[M＋H]＋；1H NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.58（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），6.27（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），5.41（1H，dd，J＝6.0、1.8 Hz，H-11），5.21（1H，dd，J＝15.6、7.2 Hz，H-23），5.13（1H，dd，J＝15.6、8.4 Hz，H-22），3.98（1H，m，H-3），2.23（1H，dd，J＝16.8、6.0 Hz，H-12a），2.05（1H，d，J＝16.8，H-12b），0.98（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），1.08（3H，s，H-19），0.98（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.82（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.80（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26），0.72（3H，s，H-18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δ：142.61（s，C-9），135.56（d，C-6），135.18（d，C-22），132.48（d，C-23），130.81（d，C-7），119.93（d，C-11），82.87（s，C-5），78.47（s，C-8），66.47（d，C-3），55.94（d，C-17），48.24（d，C-14），43.67（s，C-13），42.89（d，C-24），41.18（t，C-12），39.96（d，C-20），38.03（s，C-10），36.15（t，C-4），33.17（d，C-25），32.65（t，C-1），30.68（t，C-2），28.69（t，C-16），25.61（q，C-19），20.95（t，C-15），20.78（q，C-21），20.00（q，C-26），19.70（q，C-27），17.61（q，C-28），13.02（q，C-18）。以上数据与文献[11]报道一致，故化合物4 鉴定为5α，8α-环氧-（22E，24R）麦角甾-6，9，22-三烯-3β-醇。

化合物5白色针状结晶（二氯甲烷-甲醇＝1∶1）；10%硫酸-乙醇显色为紫红色斑点。ESIMSm/z：399.4 [M＋H]＋；1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.35（1H，m，H-6），5.21（1H，dd，J＝15.0，7.8 Hz，H-23），5.15（1H，dd，J＝15.0、9.0 Hz，H-22），3.61（1H，m，H-3），1.03（3H，s，H-19），0.98（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.96（3H，d，J＝7.8 Hz，H-28），0.88（3H，d，J＝6.4 Hz，H-27），0.86（3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.65（3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：139.04（s，C-8），135.23（d，C-22），131.42（d，C-23），117.15（d，C-7），70.80（d，C-3），55.84（d，C-17），55.01（s，C-14），49.42（d，C-9），43.15（d，C-13），42.74（d，C-24），40.42（d，C-20），40.23（d，C-5），39.42（t，C-12），37.94（t，C-4），37.13（t，C-1），34.12（s，C-10），33.06（d，C-25），31.45（t，C-6），29.62（t，C-2），28.16（t，C-16），22.91（t，C-15），21.54（t，C-11），21.12（q，C-21），19.94（q，C-27），19.61（q，C-26），17.53（q，C-28），13.04（q，C-19），12.15（q，C-18）。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物 5为麦角甾-7，22-二烯-3β-醇。

化合物6白色针状结晶（石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1）；10%硫酸-乙醇显色为紫红色斑点。ESI-MSm/z：415.4 [M＋H]＋。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：5.33（1H，m，H-6），3.48（1H，m，H-3），0.99（3H，s，H-19），0.90（3H，d，J＝6.5 Hz，H-21），0.82（3H，t，J＝7.2 Hz，H-29），0.81（3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.79（3H，d，J＝6.6 Hz，H-27），0.69（3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：140.84（s，C-5），121.79（d，C-6），71.89（d，C-3），56.85（d，C-14），56.14（d，C-17），50.22（d，C-9），45.92（d，C-24），42.20（s，C-13），42.38（t，C-4），39.86（t，C-12），37.34（t，C-1），36.59（s，C-10），36.23（d，C-20），34.03（t，C-22），31.99（t，C-2、-7），31.74（d，C-8），29.24（d，C-25），28.33（t，C-16），26.16（t，C-23），24.38（t，C-15），23.15（t，C-28），21.16（t，C-11），19.90（q，C-26），19.48（q，C-27），19.11（q，C-19），18.86（q，C-21），12.06（q，C-29），11.94（q，C-18）。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物6为β-谷甾醇。

4 结论

本文从凤丹皮内生真菌Alternaria arborescens的液态发酵物中分离得到6个甾醇类化合物。甾醇类成分作为一类重要医药化工原料，在氧化、抗菌、抗肿瘤、抗补体以及减少心脑血管疾病的发病率方面发挥着积极的作用[15]。随着黄体酮和氢化可的松等甾体类激素的微生物全合成的实现，甾体制药技术迎来一个全新阶段[16]。内生真菌Alternaria arborescens在液体培养基中产生过氧麦角甾醇在抗炎、降血糖等方面发挥较好的活性[17-18]。内生真菌的次生代谢产物受培养基及培养方式影响较大，后续的研究工作将着眼于菌株培养条件的筛选，以期固化发酵工艺，综合药效学研究结果，合理开发利用该菌株。