苗药莴比苷（商陆）中总多糖提取工艺的优选

杜洪志 王先菊 王小波 陈志琳 李玮

【摘 要】 目的：优选苗药莴比苷（商陆）总多糖的最佳提取工艺。方法：以莴比苷（商陆）为材料，以总多糖含量为指标，采用紫外-可见分光光度法，通过单因素试验及L9（33） 正交试验相结合，研究提取时间、提取次数、料液比对莴比苷（商陆）中总多糖含量的影响。结果：莴比苷（商陆）最佳提取工艺为：以蒸馏水为溶剂，超声提取60 min，料液比为1∶40（0.5 g：20 mL），提取1次。结论：通过正交试验优选的提取工艺方法可行、重复性好、总多糖提取率高，对莴比苷（商陆）质量评价及筛选关键有效部位提供参考依据。

【关键词】 苗药莴比苷（商陆）；正交试验；总多糖；提取工艺

【中图分类号】R284.2   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）08-0034-05

Abstract：Objective To optimize the extraction condition of total polysaccharide of Miao Medicine Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix） by orthogonal experiment.Methods Taking Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix） as experiment materials， and the total polysaccharide were investigated， according to the single factor experiment，L9（33）orthogonal experiment and UV-Vis spectrophotometry， to study the effects of extraction time，extraction times， solid-liquid ratio on the content of total polysaccharide of Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix）. Results The optimum extraction condition of Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix） has been established as follows： distilled water as solvent， ultrasonic extraction for 60 min， solid-liquid ratio of 1∶40 （0.5 g∶20 mL）， extraction for 1 time.Conclusion The optimized extraction method by orthogonal test is feasible， reproducible and has high extraction rate of total polysaccharide， which provides a reference for quality evaluation and screening of the key effective parts of Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix）.

Key words：Miao Medicine Vob Bix Gheib （Phytolaccae Radix）; Total Polysaccharide; Orthogonal Experiment; Optimum Extraction Condition

苗药莴比苷（商陆）为商陆科植物商陆Phytoluacca acinosa Roxb.或垂序商陆Phytolacca americana L.的干燥根。其生品性冷，味苦，属冷药，入热经，有毒。具有洼沃（泻水）、达洼渥（利尿）、泱安（消肿）之功，主用于普嘎秋（水臌病）、岗秀布（皮肤湿疹）等病症［1］。

莴比苷（商陆）主要含有三萜皂苷类［2］、黄酮类［3］、多糖类［4］等化学成分，具有利尿［5］、抗菌消炎［6］、抗肝損伤［7］等药理作用。其中多糖类主要包括商陆多糖Ⅰ、商陆多糖Ⅱ两种酸性杂多糖，其结构主要为α-（1-4）相连的多聚半乳糖醛酸［8］。有研究［9-10］报道商陆多糖能显著增强小鼠脾细胞DNA多聚酶α活性及诱导脾淋巴细胞的増殖，増强腹腔巨噬细胞、脾细胞和LAK细胞的杀瘤活性，表明该药材中多糖类物质具有较好的研究价值。为了获得较高的总多糖提取率，其提取工艺的优选成为首要解决的关键问题，以期为研究多糖类物质的生物活性及质量评价奠定前期基础。

有研究［11］报道，采用响应面法研究商陆总多糖的提取工艺，然其仅考察料液比、提取时间、提取温度三个因素，且提取时间较长。未对乙醇除杂条件、总多糖提取方法、提取次数以及显色条件等进行优化。基于此，为了有效提取苗药莴比苷（商陆）中总多糖，为后期筛选关键有效部位及质量评价提供重要参考。本文以总多糖含量为指标，采用紫外-可见分光光度法，通过单因素试验及L9（33）正交试验相结合，研究提取时间、提取次数、料液比对莴比苷（商陆）中总多糖含量的影响。并对其显色条件进行优选。旨在为该民族药资源的合理开发利用奠定一定的实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 TU-1810型紫外-可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；ME204E型万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HH-S4型电热恒温水浴锅（上海况胜实业发展公司）；HS10260D型超声清洗仪（上海易净超声波仪器有限公司）；101-3AB型电热恒温鼓风干燥箱（天津市泰士特仪器有限公司）；XL-02A型粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司）。

1.2 试药 苯酚（成都市科龙化工试剂厂，分析纯）；浓硫酸（重庆川东化工有限责任公司，分析纯）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯）；蒸馏水为实验室自制。

无水葡萄糖对照品（批号：GZDD-0523，纯度≥98%）购于贵州迪大生物科技有限责任公司；莴比苷（商陆）药材采自贵州省贵阳市花溪区，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为商陆科植物垂序商陆Phytolacca americana L.的根。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品约5.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得0.1014 mg/mL无水葡萄糖对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取莴比苷（商陆）样品粉末（二号筛）0.5 g，置于100 mL锥形瓶中，加入60 mL无水乙醇，回流提取1次，每次0.5 h，趁热过滤。用无水乙醇洗涤残渣2次，每次10 mL，弃滤液，残渣挥尽乙醇，将残渣和滤纸放入100 mL锥形瓶中，精密加入20 mL蒸馏水，称重，超声提取（功率300 W，50 kHz）1 h，补重，过滤，精密吸取续滤液1 mL置于100 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 显色条件 精密量取1 mL待测溶液，置于10 mL具塞试管中，加5%苯酚溶液1.6 mL、浓H2SO4 7 mL，充分摇匀。沸水浴5 min，冰水浴15 min。在最大吸收波长488 nm测定吸光度，以干燥品计算含量。

2.1.4 检测波长的选择 精密吸取“2.1.1”项对照品溶液和“2.1.2”项样品溶液各1 mL，按“2.1.3”项进行显色，于200～800 nm之间全波长扫描，记录最大吸收波长，结果对照品和样品溶液在488 nm处均有最大吸收，故选取488 nm作为总多糖含量检测波长。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项对照品溶液2 μL、3 μL、4 μL、6 μL、7 μL、8 μL，分别置于10 μL量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，按“2.1.3”项进行显色和测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，对照品浓度X为横坐标，得线性回归方程为：Y=8.682X-0.0073（R2=0.9999），结果表明在0.02028～0.08112 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项对照品溶液，按“2.1.3”项进行显色和测定吸光度，结果吸光度RSD值为0.63%，小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 精密吸取“2.1.2”项同一样品溶液，按“2.1.3”项进行显色，分别于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后测定吸光度，结果吸光度RSD值为0.50%，小于3%，表明样品在5 h内稳定性良好。

2.2.4 重复性试验 按“2.1.2”项平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项进行显色和测定吸光度，按“2.2.1”项线性回归方程计算含量，结果总多糖平均含量为8.82%，RSD值为2.32%，小于3%，表明方法的重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验 根据“2.2.4”项计算总多糖含量，减半称取6份样品，每份0.25 g，精密称定，分别加入等量无水葡萄糖对照品溶液，按“2.1.2”项制备供试品溶液，按“2.1.3”项进行显色和测定吸光度，按“2.2.1”项线性回归方程计算含量，结果总多糖加样回收率平均值为103.89%，RSD值为2.39%，小于3%，表明方法的准确性良好。

2.3 提取工艺优选

2.3.1 单因素试验 以乙醇为溶剂，分别进行除杂时间、乙醇浓度的单因素试验考察；再以蒸馏水为溶剂，分别进行提取方法、提取时间、提取次数、料液比的单因素试验考察，不同因素不同水平均平行3份样，按照“2.1”和“2.2”项下方法进行总多糖的含量测定。①乙醇除杂时间：30 min、60 min、90 min；②乙醇除杂浓度：100%、95%、90%、85%乙醇；③提取方法：超声提取、回流提取；④提取时间：10 min、20 min、40 min、60 min、80 min；⑤提取次数：1次、2次、3次；⑥料液比：1∶10（0.5 g∶5 mL），1∶20（0.5 g∶10 mL），1∶30（0.5 g∶15 mL），1∶40（0.5 g∶20 mL），1∶50（0.5 g∶25 mL）。

實验结果显示，莴比苷（商陆）总多糖单因素最佳提取工艺为：精密称取原药材0.5 g，加无水乙醇回流提取30 min，过滤，残渣用无水乙醇清洗两次后挥尽乙醇，将残渣和滤纸放入100 mL锥形瓶中，以蒸馏水为溶剂，超声提取60 min，提取2次，料液比为1∶30（0.5 g∶15 mL）。研究结果如图1所示。

2.3.2 显色条件的优选 分别进行显色剂加入量考察，热浴、冷浴时间的考察，不同因素不同水平均平行3份样，按照“2.1”和“2.2”项下方法进行总多糖的含量测定。①5%苯酚和浓硫酸用量（mL/mL）：0.5∶2，1.5∶6，1.6∶7、2.0∶8；②热浴、冷浴时间（min/min）：5∶15，10∶10，15∶5。

实验结果显示，莴比苷（商陆）最佳显色条件为：取稀释溶液1 mL，加5%苯酚溶液1.6 mL、浓H2SO4 7 mL，充分摇匀，沸水浴5 min，冰水浴15 min。在最大吸收波长488 nm测定吸光度，研究结果如图2所示。

2.3.3 正交优化试验考察 根据单因素试验考察结果，选择提取时间、提取次数、料液比进行正交试验，优选最佳提取工艺，每个因素设计三个水平，选用L9（33）进行三因素三水平正交试验，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.2”项进行显色和测定吸光度，按“2.2.1”项回归方程计算总多糖含量。结果正交试验因素水平见表1，正交试验结果及直观分析见表2，方差分析见表3。

由表2、表3可知，极差C＞D＞A＞B，极差A＞B＞C，由此可见，对莴比苷（商陆）多糖含量影响较大的因素依次为提取时间＞提取次数＞料液比。且提取时间具有显著性差异，因此选择A2。而提取次数、料液比均无显著性差异，因提取次数较多，费时费力，且操作步骤繁琐，误差较大，故提取次数选择1次进行验证性实验；料液比结合均值，选择1∶40（0.5 g∶20 mL）。

综上，莴比苷（商陆）总多糖最佳提取工艺为A2B1C3，即：精密称取样品粉末（二号筛）0.5 g，置于100 mL锥形瓶中，加60 mL无水乙醇回流提取0.5 h，趁热过滤。残渣用无水乙醇洗涤2次，每次10 mL。挥尽乙醇，将残渣和滤纸置于100 mL锥形瓶中，精密加入20 mL蒸馏水，称重，超声提取（功率300 W，50 kHz）1次，每次1 h，补重，过滤，精密吸取续滤液1 mL置于10 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀即得。

2.4 正交验证试验 精密称取莴比苷（商陆）药材粉末（二号筛），平行3份样，每份约0.5 g，根据正交试验考察的结果制备供试品溶液，按“2.3.2”项进行显色和测定吸光度，按“2.2.1”项回归方程计算总多糖含量，结果见表4。

按正交试验优选的最佳提取工艺提取总多糖，结果平均百分含量为8.77%， RSD<3%，高于正交试验中各项结果，表明最佳提取工艺条件稳定，重复性好，总多糖提取率较高。

3 小结和讨论

本文通过单因素试验及正交优化试验，考察了不同因素不同水平对苗药莴比苷（商陆）中总多糖含量的影響，结果以提取时间、提取次数、料液比为主要影响因素，设计L9（33）三因素三水平正交试验，优选了最佳提取工艺，并对该工艺进行了方法验证。同时，对显色条件进行了考察，进一步优化检测方法。研究结果表明提取工艺方法可行、重复性好、总多糖提取率较高，为莴比苷（商陆）质量评价及筛选关键有效部位提供参考依据。

根据正交试验结果，提取次数以3次为宜，然通过方差分析提取次数之间没有显著性差异（P>0.05）。因此，在实际应用中，若进行中试或药效学试验筛选有效部位时，因药材用量较大，可提取2～3次，合并回收滤液，以期获得高效、经济的目的；若进行样品含量测定质量控制分析时，可提取1次，以期减少实验操作误差。

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（收稿日期：2022-08-08 编辑：刘 斌）