不同光照强度和光照周期对多肋藻配子体发育的影响

陈书秀，史良，赵楠，李霞，孙娟，李晓捷

（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003）

多肋藻（Costaria costata）是一种具有较高经济价值的一年生大型褐藻，在亚洲主要分布于日本北海道、朝鲜半岛等海域，在我国无自然分布。其富含碘以及多种人体必需的微量元素，可以作为海参、鲍鱼等海洋无脊椎动物的饵料，也是海藻工业的重要原材料，具备提取褐藻胶、甘露醇、钾等化工原料以及制备褐藻淀粉的应用潜力[1-2]。目前，我国多肋藻养殖技术有了较大突破，已在山东荣成等地实现了人工养殖[3-4]。

多肋藻生长期较短，1—4 月份生长最为旺盛，5—6 月份产生孢子组织，6—7 月份藻体成熟。由于孢子体自然成熟时间晚，难以与人工育苗时间契合，配子体育苗是目前实现人工苗种适时培育最主要的手段。配子体育苗是通过控制光照、温度和营养盐成分等进行配子体扩增培养，然后对配子体进行诱导发育、附苗和幼苗的培育过程。虽然多种常见海带属藻类的配子体发育模式已经建立，但是关于多肋藻属配子体发育方面的研究，在国内外尚未见系统报道。目前国内外的研究主要集中在多肋藻生态资源调查、分类学以及利用分子生物学技术进行种群分析等方面[5-7]，以及对多肋藻配子体世代的生长发育规律进行观察研究[8-9]。从发现了海带属藻类的异形世代交替现象开始，大量关于环境因子对海带属藻类配子体生长发育的研究先后开展[10-14]，并且获得了丰富的理论研究成果，这些成果为本研究的试验设计提供了理论依据。

现于2022 年9 月，在实验室光照培养箱中，开展了不同光照强度、光照周期对多肋藻配子体发育影响的试验，拟为进一步加快多肋藻配子体细胞由营养生长向生殖发育阶段转变提供理论依据，进而用较短的时间培育出更大规格的苗种，降低人工育苗成本，为海上养殖提供更加优质苗种。

1 材料与方法

1.1 试验设计

取适量的多肋藻雌雄配子体，经循环泵处理，用孔径为48 μm 的筛绢过滤，获得含2~5 个细胞的细胞段悬浊液，然后按照质量比2∶1 混合，均匀搅拌成悬浊液。取一定量的悬浊液加入直径12 cm 的培养皿中，培养液为添加硝酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁的灭菌海水，海水中有效氮10 mg/L、有效磷1 mg/L、有效铁0.5 mg/L，温度10 ℃，蓝光（波长465~470 nm），于不同的光照强度、光照周期条件下进行培养。

1.1.1 光照强度试验

共设置7 个光照强度组，分别为10，20，40，60，80，120 和160 μmol/（m2·s）。各组培养条件相同，光照周期均为10L∶14D（L：光照时间；D：黑暗时间）。每个处理组设置3 个平行。

1.1.2 光照周期试验

共设置5 个光照周期组，分别为6L∶18D，10L∶14D，12L∶12D，16L∶8D 和20L∶4D。各组培养条件相同，光照强度均为30 μmol/（m2·s）。每个处理组设置3 个平行。

1.2 指标测定

在显微镜下观察配子体的生长发育状态，每3 d拍照1 次，试验周期30 d。

配子体发育率的计算：每个培养皿随机观察10个100×视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，按卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比，计算发育率。

1.3 数据处理

用SPSS19.0 软件对发育率进行单变量方差分析和多重比较（P<0.05 表示差异显著）。用Excel 软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同光照强度、培养天数多肋藻配子体发育状况

光照强度（P<0.001）、培养天数（P<0.001）及两者交互作用（P<0.001）对多肋藻配子体的发育均有极显著的影响（表1）。由表1 可见，第一行校正模型中的F=17.811，P<0.001，表明所用模型有统计学意义。效果量（Eta2）培养天数（0.835）大于Eta2光照强度（0.698）大于Eta2（光照强度×培养天数）（0.560），表明这3 个因素对多肋藻配子体发育的影响效应为：培养天数大于光照强度大于（光照强度×培养天数）。

表1 不同光照强度、培养天数多肋藻配子体发育率方差分析①

不同光照强度条件下多肋藻配子体发育25 d后的光学显微图见图1（a）（b）（c）（d）（e）（f）（g）。由图1 可见，多肋藻配子体在7 种不同的光强条件下培养25 d 后，均有一定数量的配子体正常发育成孢子体，较低光强[0~60 μmol/（m2·s）]条件下仍有大量配子体细胞处于营养生长状态，发育率为40%~80%。当光强≥80 μmol/（m2·s）时，仅有少量孢子体存活，无处于营养生长的配子体细胞，最终发育率＜20%。

图1 不同光照强度多肋藻配子体发育25 d 后的光学显微图（10×10 倍）

不同光照强度多肋藻配子体发育率见表2。随着培养时间的增加，配子体发育率不同程度的增加，120 μmol/（m2·s）时，在第22 天达到最大值，第25 天稍有下降，其他试验组发育率均在第25 d 达到最大值。但相同光照强度下，第22 天与第25 天的发育率相比，无显著差异。培养天数相同时，40 μmol/（m2·s）光照强度条件下的发育率最高，显著高于10，80，120 和160 μmol/（m2·s）条件下的发育率（P<0.05），但与20 和60 μmol/（m2·s）条件下的发育率差异不显著（P>0.05）。

表2 不同光照强度多肋藻配子体发育率①%

综上所述，多肋藻配子体育苗时，若采用的光照周期为10L∶14D，在配子体发育成孢子体阶段，光照强度建议保持在40 μmol/（m2·s），既有利于配子体快速由营养生长转化为生殖生长，又可提高最终的孢子体密度。

2.2 不同光照周期多肋藻配子体发育状况

光照周期（P<0.001）、培养天数（P<0.001）及两者交互作用（P<0.001）对多肋藻配子体的发育均有极显著的影响（表3）。由表3 可见，第一行校正模型中的F=19.044，P<0.001，表明所用模型具有统计学意义。Eta2光照周期（0.801）大于Eta2培养天数（0.787）大于Eta2（光照周期×培养天数）（0.586），表明这3 个因素对多肋藻配子体发育的影响效应为：光照周期大于培养天数大于（光照周期×培养天数）。

表3 不同光照周期、培养天数对多肋藻配子体发育的方差分析结果①

不同光照周期条件下，多肋藻配子体发育25 d后的光学显微图见图2（a）（b）（c）（d）（e）。由图2可见，多肋藻配子体在5 个不同光照周期条件下培养25 d 后，均有部分配子体可正常发育成孢子体。在光周期6L∶18D 和20L∶4D 条件下，约有70%配子体仍处于营养生长状态，仅有少量进入生殖生长（16%~30%），且孢子体长度明显小于其他3 组。

图2 不同光照周期条件下，多肋藻配子体发育25 d 后的光学显微图（10×10 倍）

不同光照周期配子体发育率见表4。随着培养时间的增加，配子体发育率不同程度的增加，均在第25 d 达到最大值。相同的培养时间条件下，光照周期12L∶12D 时配子体发育率最高，但与10L∶14D的发育率差异不显著（P>0.05），两者的发育率均显著高于其他3 组（P<0.05）。

表4 不同光照周期多肋藻配子体发育率①%

综上所述，多肋藻配子体育苗时，若采用的光照强度为30 μmol/（m2·s），在配子体发育成孢子体阶段，光照周期建议使用12L∶12D，有利于配子体快速同步发育。

3 讨论

光照强度、光照周期对多肋藻配子体发育存在极显著的影响（P<0.001）。经Duncan 多重检测法比较后，40 μmol/（m2·s）的光照强度和10L∶14D 的光照周期或30 μmol/（m2·s）的光照强度和12L∶12D的光照周期，对多肋藻配子体发育具有显著的促进作用。

3.1 光照强度对多肋藻配子体发育的影响

海带配子体发育模式受光照和温度等外界环境因子的影响而不同，主要表现在当配子体初始细胞经过一段时间的营养生长之后，如果外界环境因子适宜，配子体则进入繁殖生长阶段，否则继续营养生长形成丝状配子体。Borlongan 等[5]研究了多肋藻配子体阶段和孢子体阶段光合活性对PAR的响应，结果表明，配子体对低光照强度有较高的适应性，其补偿光强为1 μmol/（m2·s），饱和光强为44 μmol/（m2·s），若连续6 h 处于100 μmol/（m2·s）时，配子体将受到光损伤，且无法恢复。而孢子体阶段的饱和光强为243 μmol/（m2·s）。本试验得出了相似的结论，由图1 可见，当光照强度≥40 μmol/（m2·s）时，随着光照强度的增加，配子体细胞数量显著减少，80~160 μmol/（m2·s）时，仅有孢子体存活。

本试验结果显示，不同光照强度下，多肋藻配子体发育存在显著差异。在光照周期为10L∶14D、光照强度40 μmol/（m2·s）时发育率最高，且出现孢子体的时间早于其他各组。由此可见，40 μmol/（m2·s）光照强度更有利于多肋藻配子体的发育。一些学者的研究也得出与本研究相似的结论。付刚等[9]研究表明，当温度为15 ℃、光照强度为40 或60 μmol/（m2·s）时，多肋藻配子体的发育过程中的营养生长阶段持续时间为3~5 d，之后即可进入繁殖阶段；而当温度较低（5 ℃）、较高（25 ℃）或者光照强度较低[20 μmol/（m2·s）]时，则不利于配子的发育成熟，配子体表现出旺盛的营养生长趋势，且营养生长阶段持续时间长。

张喜昌等[15]研究表明，“中宝1 号”海带（Saccharina japonica）配子体预发育的最适光照周期和光照强度为12L∶12D 和37.5 μmol/（m2·s）。陈书秀等[14]研究了光照强度对笼目海带（Saccharina sculpera）配子体的发育，结果表明，在光周期为10L∶14D 时，笼目海带配子体发育的最适光照强度为20~40 μmol/（m2·s）。Lee[16]的研究表明，当光照强度为80 μmol/（m2·s）时，皱海带（Laminaria relifiosa）配子体的繁殖率达到最大。Lüning 等[17]研究表明，通常条件下海带配子体在充足光照下，会进入生殖生长阶段，在低光照下，则维持营养生长状态。

3.2 光照周期对多肋藻配子体发育的影响

藻类的生长既与光照强度有关，也与光照时间的长短密切相关。本试验中，配子体发育率在光照周期12L∶12D 时最高，且随着光照时间的减少或降低，多肋藻配子体发育率明显下降，在6L∶18D 和20L∶4D 时，大部分配子体仍处于营养生长状态。由此可见，光照强度为30 μmol/（m2·s）时，多肋藻配子体发育的最适光照周期为12L∶12D。

陈书秀等[14]研究表明，笼目海带在15μmol/（m2·s）光照强度下，较长的光照时间（16L∶8D、20L∶4D），有利于促进配子体的生殖生长进程，促进卵囊的形成、受精卵的排放及孢子体的生长。张鑫等[18]研究了不同光照周期对羊栖菜（Hizikia fusiformis）有性繁殖过程的影响，结果表明，长光照周期可以明显促进卵子的排放，延长卵子的存活时间，提高卵子的受精效率，有利于合子的发育与生长。