HCV 复方制剂防治对虾弧菌病药效学研究

朱宇嘉，朱志东，董碧莲，蔡延渠，辛年香，朱盛山

（1.广州市普精生物科技有限公司，广东 广州 510653；2.广东药科大学中药开发研究所，广东 广州 510006）

根据联合国粮农组织（FAO）2016 年的报告[1]，2015 年全球对虾总产量达到691.5 万t，产值约500 亿美元。FAO 的统计数据显示[2]，由于病害，目前全球对虾养殖成功率不足30%。

近年来，对虾弧菌病多发，对养殖生产造成较大影响。对虾弧菌病即弧菌感染引起的传染性疾病，我国对虾养殖常见致病性弧菌包括：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, V.p）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi, V.h）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, V.a）等。弧菌病主要症状包括：对虾活力不足、游塘、吃料能力下降；虾塘可见白便、死亡；体表观察可见：肌肉白浊、空肠空胃、肠道发红等；解剖观察可见：肝胰腺萎缩、褪色、表层腐烂、白膜消失等。弧菌病具有很强的传染性，感染率可达100%，发病严重的虾池死亡率可达90%以上。2019 年，国际动物卫生组织（OIE）在报告中，列举了包括抗生素、微生物制剂等热门药品，但无一能有效防治弧菌病。文献[3]采用抗生素、蛭弧菌等药品，在实验室中开展治疗弧菌病试验，取得一定的效果，但在实际应用中效果不佳。目前全球尚无有效防治弧菌病的药物。HCV 复方制剂（以下简称HCV）系中草药提取物，成分包括半边莲花、土香薷、檵木叶等8 种植物。现通过临床试验，验证HCV 在养殖环境中防治弧菌病的药效。

1 材料与方法

1.1 试验设计

时间为2019 年8 月13 日—10 月27 日。试验地位于广东省江门市。选择14 口土塘（1＃—14＃），均为矩形，单个塘面积均为（7 337±1 334）m2，水深均为（1.2±0.2）m。设置1＃和2＃为空白组，3＃—14＃为用药组。根据使用HCV 节点的不同，用药组又分为全程预防组（3＃—6＃）、早用药组（7＃—10＃）和晚用药组（11＃—14＃），每组各4 口塘。虾塘基础数据见表1，所有数据于投苗当天检测。

表1 试验虾塘基础数据

1.2 材料

试验用HCV 复方制剂由广东药科大学中药开发所制备；凡纳滨对虾（Litopenaeus Vannamei）虾苗购自海大集团（海兴农1 号苗），经检测，桃拉综合征病毒（TSV）、虾血细胞虹彩病毒（SHIV）、虾黄头病毒（YHV）、对虾白斑病毒（WSV）等均呈阴性；饲料（20 kg/包）购自广东省阳江正大饲料有限公司。

1.3 弧菌病诊断

诊断依据主要为3 个症状：肝胰腺内有弧菌、吃料能力下降以及出现死虾。

1.3.1 肝胰腺弧菌检测

每5 d 检测1 次对虾肝胰腺弧菌，对病虾用药后连续检测7 d，每天10：00—11：00（投喂药料1 h 后）检测1 次。检测方法如下：从料台随机取5 尾肠道饱满对虾，将其放于蒸馏水中游15 min，剥离对虾肝胰腺，于蒸馏水中浸泡5 min，后置于干净器皿中，捣碎，收集至容器，加入0.2% NaCl 溶液至5 mL，摇匀。分别吸取0.05 mL 溶液，滴入5 个TCBS 培养皿中，涂匀。将培养皿于33 ℃恒温箱放置18 h，取出观察，计算培养皿中菌落数后，去除菌落数最多与最少的培养皿，选取剩余3 个皿的结果，求平均数。估算每个肝胰腺平均菌落数（即培养皿中菌落数100 倍），作为检测结果。

1.3.2 记录对虾吃料量

养殖过程中，每天分别于06：00、11：00 和16：00投喂1 次。从投苗后第20 d 起，每次投料后，在料台留约投喂量1%的饲料，观察料台，如饲料能在1.5 h 内吃完，则判断对虾已吃饱；如连续2 d 投料，对虾能在1.5 h 内吃完，后一餐加料5%；如连续3 餐投料1.5 h 未吃完，则记录虾塘出现减料现象，并从下一餐起根据病情减料投喂。

1.3.3 记录死亡量

对虾濒死时，喜聚集于增氧机底部等溶氧量较高的地方。于每日早晚，分别从虾塘增氧机底部捞取死虾，记录总数。

1.4 HCV 复方用药

1.4.1 全程预防组

从投苗当天开始，按每隔4 d 用药2 d、1 次/d的方式用药。10 万尾虾用药量见表2。由投苗量、养殖阶段与用药量关系，计算HCV 复方用量（预防用量），采用对虾30 min 的吃料量拌匀，晾10 min 后，全塘均匀泼洒。

表2 10 万尾虾用药量mL

1.4.2 用药组

每个疗程均为连续用药2 d、早晚各1 次的方式用药。早用药组：在对虾出现减料现象且肝胰腺内检测出弧菌时，开始用药。晚用药组：即对虾出现连续2 d 死亡量＞5 尾或减料比例＞50%，同时肝胰腺内检测出弧菌时，开始用药。用药量参照表2。

1.4.3 空白组

空白组不用任何可抑杀弧菌药物（包括蛭弧菌、抗生素、HCV 复方等）。

2 结果与分析

2.1 养殖结果

空白对照组2 口虾塘均持续出现减料和死亡现象，后因死亡量过大且无法遏制，分别在第40 和48 d 放弃养殖。全程预防组4 口试验塘中，2 口塘未出现病情，2 口塘出现1 次减料现象。早用药组中，4 口试验塘均出现过不同程度的减料现象，其中2 口塘出现死亡现象。晚用药组中，4 口试验塘均出现死亡、减料现象。试验塘养殖结果见表3。

表3 试验池塘养殖结果

2.2 死亡量和吃料率

对虾吃料率，即对虾发病后用药前一餐（1.5 h）吃料量占病前7 d 内最大吃料量的比例。

2.2.1 空白组

空白组吃料率下降到80%以下当天，记录为d0，记录d0 到d6（d0 后第6 天）死亡量和吃料率数据，见图1（a）（b）。

图1 空白组死亡量和吃料率

2.2.2 全程预防组

因全程未出现连续3 d 死亡且单日死亡量≥5尾现象，全程预防组死亡量未记录。全程预防组中，2口虾塘未出现减料现象，2 口塘出现。出现减料现象的池塘，第1 次用药当天记为d0，d0 至d6（d0 后第6 天）吃料率记录见图2。

图2 全程预防组用药后吃料率

2.2.3 早用药组

因全程未出现连续3 d 有死亡且单日死亡量≥5 尾现象，早用药组死亡量未记录。早用药组4 口虾塘均出现减料现象，以第1 次用药当天为d0，d0至d6（d0 后第6 天）吃料率见图3。

图3 早用药组吃料率

2.2.4 晚用药组

以第1 次用药当天为d0，晚用药组d0 至d6（d0 后第6 天）死亡量、吃料率记录见图4（a）（b）。

图4 晚用药组死亡量、吃料率变化

2.3 肝胰腺弧菌量检测

4 个试验组肝胰腺弧菌量检测结果见图5。图5 所示数值为各组虾塘当天弧菌量平均值。全程预防组中，2 口塘（3#和5#）未出现病情，未用药治疗，故其检测数据未在图5 中体现。

图5 用药前后弧菌量检测结果

试验发现，空白组因病情无法遏制而放弃养殖；全程预防组基本不受弧菌病影响；治疗用药1 h后，肝胰腺弧菌被抑杀；早用药组用药2 d，吃料率回升；晚用药组用药后，吃料量上升，但至d6，所有试验塘均未超过病前最高吃料量；晚用药组d6，死亡现象基本消失。全程预防组平均产量是早用药组的1.4 倍、晚用药组的2.3 倍，早用药组平均产量是晚用药组的1.7 倍，可见预防优于治疗，应及早用药。

3 讨论

3.1 抑菌与弧菌病防治效果对比

研究[4]发现，对于弧菌病，恩诺沙星、诺氟沙星、氟甲喹等至少需要连续用药14 d，才可降低对虾死亡率，用药周期长。而HCV 使用1 次后，对虾肝胰腺中弧菌被抑杀，吃料量均超出病前，死亡现象基本消失，相比上述抗生素更具速效优势。蛭弧菌难以作用于发病部位[5-6]，HCV 用药1 次后，可抑杀肝胰腺中弧菌，有效性优于蛭弧菌。文献[7]测试了11 种常见植物提取物对5 种常见弧菌的最小抑菌浓度（MIC）值为5~40 g/L；文献[8-9]测试厥藻类、石莼MIC 值为1.5 g/L。HCV 是由文献[7]中NZ 处方及其提取工艺优化而来，MIC 为0.25 g/L，远低于上述植物提取物。

3.2 药效可行性

本试验在室外养殖环境中完成，实验室环境与虾塘养殖环境主要区别是：（1）弧菌菌种不一致或致病弧菌并非单一弧菌；（2）养殖环境包括水质、天气等因素多变且每口塘之间存在差异性；（3）对虾健康程度、发病时间、疗效观察等存在差异。

FAO、OIE 在报告[2，10]中指出，目前仍无可防治弧菌病药物。HCV 在养殖虾塘试验中，成功防治弧菌病，显著提高了养殖收益，不仅解决无药可治这一难题，还为研制防治对虾弧菌病中草药新产品，提供了养殖环境试验依据。

3.3 病情复发

早用药组与晚用药组在用药治疗后，出现病情复发现象，可能是再次感染弧菌。感染源可能来自虾塘环境中，尤其是底泥中的弧菌，以及活虾啃食感染弧菌的死虾。因此，弧菌病复发率高，需加强预防。