瘤内微生物与胰腺癌的治疗

欧苏文 孙备 李乐

哈尔滨医科大学附属第一医院胰胆外科 肝脾外科教育部重点实验室,哈尔滨 150001

【提要】 微生物作为肿瘤内重要的生物学组分,在肿瘤发生、进展及药物治疗反应等多个方面发挥重要功能。瘤内微生物群在胰腺癌病因学研究领域取得一定进展。本文系统解析胰腺肿瘤内微生物特征及其对肿瘤生长、转移和免疫微环境的影响,阐述基于瘤内微生物的胰腺癌潜在治疗策略,以期为相关领域研究提供更多的思路与见解。

胰腺癌恶性程度极高,80%～85%的患者在确诊时即为不可切除或出现远处转移,其5年生存率不足10%[1-2]。作为重要的消化性器官,胰腺曾被认为处于“无菌状态”,然而,越来越多的研究证实,正常胰腺组织或胰腺肿瘤组织内均存在特定的微生物。瘤内微生物虽被证实能够参与胰腺肿瘤的发生与进展,但其对胰腺癌生长、转移及药物治疗方面的调控机制仍不明确。本文系统解析胰腺良、恶性肿瘤瘤内微生物多样性,探讨瘤内微生物在胰腺癌治疗领域的应用价值,并结合笔者团队工作,浅谈目前瘤内微生物在胰腺癌研究领域的诸多问题及争议,为该领域相关研究拓展新的思路。

一、胰腺肿瘤内微生物的来源

生理状态下,胰腺组织内存在少量微生物,当肿瘤发生时,肿瘤内部的微生物丰度可升高至正常组织的1 000倍[3]。这些微生物源自何处是一个值得探讨的问题。一方面,从解剖学角度,胰腺病变导致胰液的成分或pH改变,使微生物易于通过胰管逆行进入胰腺[4-5]。另一方面,肠道细菌可能自主进入肠系膜淋巴结,进而通过免疫细胞运输至胰腺[6-8]。笔者研究发现,在急、慢性胰腺炎及胰腺肿瘤小鼠模型中,肠道菌群失衡可导致肠道局部炎症反应,主要表现为炎症因子如IL-17等大量释放,进而破坏肠道屏障功能,导致肠道内细菌极易透过肠道屏障,进入血液或者肠系膜淋巴组织,最终迁移至胰腺。此外,正常胰腺与胰腺肿瘤中均可检出常见口腔细菌,如牙龈卟啉单胞菌等,并且,其菌群组成与口腔菌群极为相似,提示细菌还能够借助“口腔-血液途径”实现口腔菌群的重定位[5,9-10]。

二、胰腺肿瘤内微生物的特征

因特殊的组织学特性,胰腺囊性肿瘤内微生物菌落极为独特。Li等[11]研究发现,胰腺囊性占位的囊液中主要以拟杆菌属、埃希菌属或志贺菌属和氨基酸球菌属为主;并且不同类型囊性占位囊液中的微生物组成并无差异。作为最常见的胰腺囊性肿瘤,胰腺导管内乳头状黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)囊液中细菌丰度显著高于其他类型囊性肿瘤[12],而且高度不典型增生IPMN囊液的细菌DNA拷贝数显著高于低度不典型增生IPMN。高度不典型增生IPMN囊液内主要以颗粒菌属、沙雷菌属和梭杆菌属为主,而低度不典型增生的IPMN囊液则以甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和丙酸杆菌属为主。Hozaka等[13]对IPMN和正常胰腺组织的石蜡样本进行16s rDNA 测序,发现二者在物种丰度与多样性方面并无差异,但浸润型IPMN中梭杆菌的相对丰度显著高于非浸润型IPMN,提示瘤内微生物可能参与IPMN的进展[14]。目前,多数研究通过对比胰腺良性或低度恶性肿瘤与恶性肿瘤瘤内微生物的差异,探究其在肿瘤诊断以及良、恶性鉴别中的应用价值。然而,因不同类型胰腺囊性肿瘤的组织结构、起源均不尽相同,瘤内微生物多样性及成分复杂,同时,部分囊液的获取依赖于超声内镜等手段,获得的瘤内微生物易受到医源性操作的影响,如胃内容物及口腔细菌污染等,因此,笔者建议应慎重看待瘤内微生物在评估胰腺肿瘤良恶性方面的作用。

对于胰腺癌与正常胰腺组织内的菌群是否存在差异这一问题,目前仍存争议[9,15-16]。研究发现,胰腺癌组织中主要以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为主;卟啉单胞菌属、梭杆菌属、普雷沃菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、嗜血杆菌属及月形单胞菌属丰度也较正常组织更高[5,9,15-17]。另外,不同预后的胰腺癌患者的肿瘤组织内的菌群组成也存在明显差异,长期生存的患者比短期生存患者的肿瘤组织内菌群多样性更高[18]。基于基因组和转录组特征,胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)可分为基底样、经典和混合亚型[19]。基底样肿瘤更具侵袭性且预后更差,微生物组分析提示,肿瘤内主要以不动杆菌属、假单胞菌属和Sphingopyxis属为主,且其丰度与肿瘤预后呈负相关[20]。此外,真菌作为另一类常见微生物,也被证实与胰腺癌的进展相关[21-22]。Aykut等[3]研究发现,PDAC组织中子囊菌门和担子菌门显著升高;进一步研究提示,肿瘤组织中马拉色菌属主要参与PDAC进展。

笔者认为,目前关于胰腺癌菌群鉴定与分析中存在以下几点问题:(1)由于样本取材、处理及保存方式的不同,易导致外源性细菌的污染,影响结果的可靠性。大多数研究采取石蜡切片进行菌群分析,切勿忽略石蜡包埋过程中造成的微生物污染,因此,采取适当的对照样本,有助于合理排除“潜在”污染的微生物,也是获得准确结果的关键。(2)不同的测序手段、分析方法导致结果的不一致或不可重复。目前常规应用的测序方法包括细菌16s rDNA、真菌ITS测序以及宏基因组测序等,然而,各种方法孰优孰劣?16s rDNA与ITS测序获取的微生物的类别较少,并且需要合理排除测序过程中导致的其他外源性微生物干扰。对于宏基因组测序,因尚缺乏适用于瘤内微生物注释的数据库及金标准,导致不同注释策略获得的结果存在一定的差异,因此需要慎重选择[3,23-24]。

三、瘤内微生物促进胰腺癌生长和转移

胰腺癌因其生长迅速且易出现早期转移,进而失去手术时机,导致预后较差。瘤内微生物被证实通过一系列机制参与胰腺癌进展,如牙龈卟啉单胞菌激活肿瘤细胞内AKT信号通路,进而促进肿瘤细胞增殖[9,25];在小鼠模型中,胰腺癌内真菌,如球形马拉色菌能通过激活甘露糖结合凝集素或补体3促进胰腺癌生长[3]。然而,在体外实验中,不同细菌感染复数(multiplicity of infection,MOI)对肿瘤细胞的增殖能力影响差异巨大,较低的MOI(如1∶1或50∶1)能够促进肿瘤细胞生长,而较高的MOI(500∶1)则抑制肿瘤生长[9]。笔者认为,需合理应用体外模型研究微生物对肿瘤细胞增殖能力的影响。就研究方法而言,采用与瘤内细菌相同或近似的微生物丰度干预肿瘤细胞,才能准确地反映其对肿瘤生物学特性的改变。此外,瘤内微生物还能够影响肿瘤细胞转移,如具核梭杆菌通过诱导胰腺癌细胞与癌旁正常细胞以自分泌和旁分泌的方式释放炎症因子(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、C-X-C基序趋化因子配体1、IL-8及巨噬细胞炎性蛋白3α等),促进肿瘤细胞的侵袭与迁移[26-27]。胰腺癌肿瘤微环境中不仅包括大量肿瘤上皮细胞与肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs),还包括各种免疫细胞以及内分泌细胞等,那么何种细胞主要参与瘤内微生物介导的肿瘤转移?笔者研究发现,瘤内微生物广泛存在于肿瘤上皮细胞与CAFs中,随着单细胞研究技术的广泛应用,能够更清晰地描绘瘤内微生物在不同肿瘤成分中的分布,结合转录组测序技术,可以进一步理解瘤内微生物在不同细胞亚群中的功能及其在肿瘤进展中的作用与动态变化。

四、瘤内微生物重塑肿瘤免疫微环境

胰腺癌瘤内菌群能够重塑肿瘤免疫微环境,影响肿瘤生长及对药物治疗的反应。在KrasG12D/Pdx1-Cre小鼠模型中,抗生素能够有效清除胰腺内微生物,抑制组织内骨髓源性免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)富集,促进M1型巨噬细胞、CD4+T细胞Th1分化及CD8+T细胞激活[15]。同时,组织内微生物选择性激活Toll样受体,驱动单核细胞向肿瘤抑制性表型分化,介导T细胞的免疫耐受,最终加速肿瘤进展。Riquelme等[18]通过构建人源化粪菌移植小鼠模型,证实了来自长期生存的胰腺癌患者的肠道菌群通过改变胰腺肿瘤内菌群组成,增强肿瘤CD8+T细胞活化并抑制MDSC和调节性T细胞富集,从而遏制肿瘤生长。此外,肿瘤内某些特定微生物也被证实通过调控免疫影响肿瘤进展。具核梭杆菌通过CXCL1-CXCR2轴诱导的MDSC向瘤内迁移,抑制CD8+T细胞浸润,加速肿瘤生长[26];牙龈卟啉单胞菌通过刺激中性粒细胞趋化因子的产生,进而招募中性粒细胞浸润及诱导弹性蛋白酶分泌,促进肿瘤进展[9]。那么是否可以通过重塑肠道菌群进而影响胰腺及肿瘤免疫微环境?笔者研究发现,对抗生素处理后的小鼠进行粪菌移植能够显著上调胰腺组织中菌群相对丰度,同时可影响组织内巨噬细胞及中性粒细胞及CD8+T细胞的分布,提示可以通过粪菌移植实现对胰腺癌内肿瘤菌群丰度的调控,进而实现对胰腺癌组织内免疫微环境重塑[28-29]。

五、瘤内微生物对胰腺癌治疗的影响

Geller等[30]研究发现,携带长型胞苷脱氨酶(long isoform of the enzyme cytidine deaminase,CDDL)基因的一大类细菌能够诱导肿瘤细胞对吉西他滨的耐药。CDDL通过代谢吉西他滨使其失活,降低肿瘤内药物浓度,使肿瘤细胞得以逃避化疗药物的杀伤。含有CDDL的细菌主要属于γ变形菌门,且其已被证实在胰腺癌组织中具有较高的丰度。上述结果提示,通过改变肿瘤内特定菌群丰度能够逆转以吉西他滨为核心的化疗耐药。抗生素作为系统性清除细菌最简单易行的手段,已被证实能够显著延长转移性或不可切除胰腺癌患者预后,而其对可切除肿瘤患者预后无明显影响;并且抗生素能够有效增强以吉西他滨和5-氟尿嘧啶为基础的化疗效果,这也提示通过特定抗生素靶向干预肿瘤组织内菌群将有助于提高肿瘤对化疗的反应[31]。免疫治疗适用于高微卫星不稳定或错配修复基因缺陷的亚型肿瘤,由于胰腺癌组织内缺乏免疫细胞浸润且仅有2%肿瘤存在上述突变,免疫治疗的效果差强人意[32]。虽然有研究提示,口服抗生素联合抗PD-1能够延缓胰腺癌进展,但其对肿瘤内菌群改变的作用以及肿瘤免疫状态的影响仍需进一步探究[15]。

六、针对瘤内微生物的治疗策略

瘤内微生物广泛存在且具组织特异性,针对瘤内菌开发靶向治疗手段将为胰腺癌治疗提供全新的方向。笔者认为,抗生素虽然能够降低肿瘤内微生物丰度,但长期应用极易导致细菌耐药、肠道菌群紊乱及继发真菌感染等,其安全性与可靠性备受争议。虽然目前众多研究试图探究如何通过精准给药改变肿瘤内菌群丰度,实现对化疗药物的增敏作用,然而,目前研究的局限性在于(1)缺乏合理的动物模型。大多研究采用小鼠皮下瘤模型予以瘤内注射或者瘤旁注射的方式,最大程度改变肿瘤内微生物丰度,然而,因皮下瘤通过皮肤直接与外界接触,其微生物丰度难以控制。(2)靶向特定器官抗生素的筛选。目前尚无靶向抗生素能够特定到达胰腺或者胰腺癌内,实现对靶器官微生物的定点清除。研究显示噬菌体可以感染和裂解细菌,且对细菌物种具有高度的特异性,在治疗细菌感染方面具有一定的优势,因此,噬菌体疗法已被考虑作为清除瘤内细菌的一种手段[33-34]。通过构建以噬菌体引导的“生物-非生物混合纳米系统”,不仅能够清除瘤内具核梭杆菌,还能够增强化疗反应、降低药物用量及其毒性[35]。此外,通过肠道菌群移植、瘤内菌群干预等方式改变瘤内微生物,也可作为一种潜在治疗策略。

七、未来展望

瘤内微生物作为一个全新领域,在肿瘤治疗方面存在巨大潜力,但目前尚缺乏基于临床样本的大规模测序分析,需要通过解析、识别及验证特定微生物在肿瘤中的丰度,并可视化其在肿瘤微环境中的定位,进一步采用多组学研究策略,系统揭示瘤内微生物与转录组、代谢组之间的内在联系。此外,微生物与肿瘤微环境的交互机制仍有待于进一步探索,需要通过微生物与肿瘤细胞、CAFs、免疫细胞等共培养等技术手段,深入探究瘤内微生物对不同细胞亚型的调控作用及其在肿瘤生长、转移及药物治疗等方面的分子机制。上述研究不仅有助于推动微生物移植或益生菌治疗在临床中的探索,同时也为进一步开发靶向相关通路、关键蛋白和代谢物的小分子抑制剂,提高肿瘤对化疗甚至免疫治疗的反应提供更多的转化基础。

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