不同产香酵母接种方式对甜面酱品质的影响研究

王萌 饶佳薇 孟凡冰 李云成 刘达玉 邹龙华

摘要：通过向甜面酱保温发酵过程中添加不同种类（鲁氏酵母和异常威克汉姆酵母）和不同比例（1∶2、1∶1、2∶1）的耐盐产香酵母，对比不同产香酵母接种方式对甜面酱品质及风味的影响。结果表明，先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母，且二者比例为1∶1时，更有利于氨基酸态氮和有机酸的积累，保温发酵结束后，产品的还原糖含量为20.02 g/100 g，总酸含量为2.21 g/100 g，氨基酸态氮含量为0.49 g/100 g，有机酸含量为5.61 mg/g。产品中共检测出挥发性风味成分45种，含量为84.36×10-2 μg/g。综合理化指标及风味成分指标，甜面酱保温发酵过程中最优的酵母添加方式为先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母，且二者添加比例为1∶1时更有利于保温发酵甜面酱品质和风味的提升。

关键词：甜面酱；保温发酵；产香酵母；添加方式；品质

中图分类号：TS264.24      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0073-07

Abstract： Different kinds （Zygosaccharomyces rouxii and Wickerhamomyces anomalus） and different proportions （1∶2， 1∶1， 2∶1） of salt-tolerant aroma-producing yeasts are added into sweet soybean paste during the insulation fermentation， and the effects of different aroma-producing yeast inoculation methods on the quality and flavor of sweet soybean paste are investigated. The results show that when add Zygosaccharomyces rouxii firstly and then add Wickerhamomyces anomalus， and the ratio of the two kinds of yeasts is 1∶1， the accumulation of amino acid nitrogen and organic acid is more favorable.After insulation fermentation， the content of reducing sugar， total acid， amino acid nitrogen and organic acid is 20.02 g/100 g， 2.21 g/100 g， 0.49 g/100 g and 5.61 mg/g respectively.A total of 45 kinds of volatile flavor components with the content of 84.36×10-2 μg/g are detected in the product.Based on the physicochemical indexes and flavor component indexes， the optimal adding method of yeasts in the insulation fermentation process of sweet soybean paste is adding Zygosaccharomyces rouxii firstly and then adding Wickerhamomyces anomalus， and the ratio of the two kinds of yeasts is 1∶1， which is more beneficial to improving the quality and flavor of fermented sweet soybean paste.

Key words： sweet soybean paste; insulation fermentation; aroma-producing yeast; adding method; quality

甜面醬是以小麦或面粉为主要原料，经蒸煮熟化后，由微生物制曲和发酵制得的一种咸中带甜的半固体酱类调味品。在发酵过程中，通过微生物及酶的作用，将蛋白质、淀粉等大分子分解转化成多种小分子营养物质和风味成分[1-3]，赋予甜面酱独特的滋味、浓郁的香气和诱人的色泽[4-5]，因此甜面酱常用于佐餐、烹饪、食品加工中调味赋色[6]。甜面酱酿造主要分为制曲和发酵两个阶段，在每个阶段都有丰富的微生物参与促进各种生化反应。发酵微生物是发酵制品在整个生产过程中至关重要的因素之一[7]，决定着其最终成品的品质。目前甜面酱的酿造大多采用自然发酵，没有采用人工强化接种发酵，同时由于大多数甜面酱生产企业的研究条件简陋，对发酵微生物的选育和接种发酵工艺研究不足[8]。

在甜面酱的酱醪发酵阶段，产香酵母的代谢对甜面酱的挥发性风味形成至关重要[9-12]。酵母菌首先利用原料中的可发酵糖进行糖酵解和三羧酸循环反应，产生醇类、醛类、酮类、酸类等物质，再进一步反应生成酯类等成分，这些挥发性成分最终构成了酱制品的主体香气[13]。酱制品的香气不仅与酵母的种类密切相关，添加方式的不同对其品质和风味的影响也较大[14-15]。王从从等[16]研究了易变球拟酵母和鲁氏酵母两种酵母添加方式对甜面酱的影响，发现先添加易变球拟酵母后添加鲁氏酵母的方式有利于改善甜面酱的品质，但该研究没有探究不同酵母接种比例对产品品质的影响。

在前期研究中，从豆酱曲中分离出一株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Waro03，该菌株在产酯能力上较其他酵母有明显的优势[17]，因此在酱制品酿造中具有较高的应用价值。通过常压室温等离子体（ARTP）诱变和进化工程选育，得到的工程菌株ZMS57能够耐受20%的盐浓度，已将其应用于酱油酿造[18]。因此，在本研究中，将ZMS57与酱制品酿造常用的鲁氏酵母AS2.180应用于甜面酱保温发酵，并探究了不同添加方式（添加顺序、添加比例）对甜面酱品质和风味的影响。本研究可为甜面酱保温发酵工艺开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

麸皮、面粉、土豆：成都市好乐购超市；鲁氏酵母AS2.180（CICC 1379）：购自中国工业微生物菌种保藏中心，经本实验室筛选培育；异常威克汉姆酵母ZMS57：由实验室选育。

1.2 试剂

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨：北京奥博星生物科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）、草酸、奎尼酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、2-甲基-3-庚酮（均为色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；吐温80、氯化钠、丙三醇、苯酚、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）、乙醇（色谱纯）：成都科隆化学品有限公司；甲醛（分析纯）：上海展云化工有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

BioTek酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；BSC-250恒温恒湿箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；G7000D气相色谱-质谱联用仪、Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 7890B气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 培养基配制

PDA斜面培养基：将土豆切块放入锅中，加水100 mL，煮至土豆松散绵软，用纱布过滤，弃滤渣，加入纯水将滤液定容至100 mL，加入葡萄糖2 g、琼脂2 g，121 ℃灭菌15 min。

种曲培养基：向麸皮中加入质量相同的水，混合均匀，分装后灭菌。

成曲培养基：将使用PDA斜面培养基活化后的米曲霉接种至种曲培养基中，35 ℃培养2～3 d，直至培养基中孢子呈绿色。

1.4.2 甜面酱发酵工艺

种曲培养：将PDA斜面培养基活化后的米曲霉接种至种曲培养基中，35 ℃培养2～3 d，直至培养基中孢子呈绿色。

面糕曲（成曲）制备工艺流程：小麦粉→加水拌和→蒸料→冷却→接菌→培养→面糕曲[4]。

选择特制一等小麦粉（蛋白质含量17%）。缓慢加入30%的水进行拌和形成絮状，将和好的面料放入容器中蒸制20 min。蒸料结束后置于曲盘上，冷却至40 ℃以下后接入米曲霉。

按照SB/T 10315－1999中的方法對成曲培养基中米曲霉孢子数进行计算。计算后接入米曲霉孢子量为1×107个/g湿料，将计算好的孢子均匀铺洒在熟制后的面絮料上，然后与之混匀，进行制曲。制曲温度32 ℃，湿度90%，时间48 h。

甜面酱保温发酵工艺流程：面糕曲（成曲）→入发酵容器→加盐水→保温发酵→加酵母→增香发酵[4]。

在无菌水中加入食盐配制浓度为18%的盐水[8]。将面糕曲置于发酵罐中，加入与面糕曲质量为1∶1的盐水。待盐水全部渗入面糕曲后，盖上发酵罐盖，在45 ℃下高温发酵15 d，每隔24 h搅拌一次。发酵结束后将甜面酱温度降至30 ℃，将甜面酱平均分为9份，分别转移至发酵罐中，添加一定量酵母菌，发酵45 d，每隔5 d取样进行理化指标的检测。

酵母添加方式与添加量见表1，酵母先后添加时间差为10 d，酵母添加总量为1×107 CFU/g湿料。

1.4.3 理化指标检测

取2 g酱醪，加入50 mL的超纯水混合均匀，50 ℃水浴20 min，水浴后以8 000 r/min离心5 min，取上清液，残渣再加入超纯水重复上述操作2次，收集上清液后定容至100 mL。

还原糖的测定：还原糖含量使用DNS法测定[4]：样品经适当稀释，取0.5 mL稀释液，加入1.5 mL DNS试剂、1 mL纯水，沸水浴5 min，定容至10 mL，吸取200 μL反应后溶液至96孔板，使用酶标仪在540 nm下测量吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。

总酸的测定：参考国标GB 18186－2000中的方法测定总酸含量，吸取稀释后样品20 mL于250 mL烧杯中，加入60 mL纯水，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH为8.20即停止滴定，记录NaOH用量以计算总酸含量。

氨基酸态氮的测定：吸取稀释后样品20 mL于250 mL烧杯中，加入60 mL纯水，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH为8.20，然后加入10 mL甲醛，继续滴定至pH为9.20即停止滴定，用80 mL纯水做空白对照。

氨基酸态氮含量=（V1-N）×C×0.014V3V2×100。

式中：V1为样品滴定时消耗0.05 mol/L氢氧化钠溶液毫升数；N为空白样滴定时消耗0.05 mol/L氢氧化钠溶液毫升数；C为氢氧化钠溶液的当量浓度（mol/L）；0.014为氮的毫克当量；V2为取样量；V3为稀释倍数。

有机酸的测定：有机酸的测定参考王沛[19]的方法。

流动相的配制：准确称取KH2PO4 4.082 7 g，用适量纯水溶解，定容至1 L，用磷酸调pH值至3.0±0.2，经0.22 μm水系滤膜抽滤2遍，超声脱气30 min，冷却至室温备用。

样品预处理：称取甜面酱成品1.00 g，定容于25 mL容量瓶中。取一定量的稀释液，离心后，取上清液，再经0.22 μm滤膜过滤，待上机检测。

液相色谱条件：利用Agilent 1260高效液相色谱仪检测，色谱柱：Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm），使用紫外检测器检测，检测波长210 nm，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，流动相为KH2PO4溶液∶水为95∶5。

1.4.4 挥发性风味物质的测定

甜面酱挥发性风味物质采用顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC/MS）技术进行测定。

HS-SPME萃取条件：称取5.00 g的甜面酱样品于15 mL顶空瓶中密封，加入内标2 μg/μL 2-甲基-3-庚酮1 μL。75 ℃下平衡45 min，样品抽取20 min，解吸5 min。

色谱条件：采用石英毛细管柱Agilent 19091S-433UI HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为He，压力32.0 kPa，流速1 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流进样。升温程序：40 ℃保持5 min后，以2 ℃/min的速率升至60 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速率升至150 ℃，最后以20 ℃/min的速率升至200 ℃。

质谱条件：电子电离源（EI）；电子能量 70 eV；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；检测器电压350 V；质量扫描范围（m/z）：35～350。

定性：将得到的数据在仪器的NIST 14谱库中进行检索和匹配，选择匹配度高于70%的物质。同时在相同色谱条件下对正构烷烃进行扫描，计算线性保留指数（retention index，RI），将计算值与NIST Chemistry WebBook中检索的已发表文献中RI比对。RI计算公式如下：

RI=Ta-TnTn+1-Tn+n×100。

式中：Ta为a物质的保留时间；Tn为a物质前一个正构烷烃的保留时间；Tn+1为a物质后一个正构烷烃的保留时间；n为碳原子数。

定量：绝对含量根据其在总离子图中的峰面积与内标的峰面积进行比较，结果以“×10-2 μg/g”的形式表示绝对含量；各挥发性风味成分的相对含量采用面积归一化法计算。

2 结果与分析

2.1 不同酵母接种方式对甜面酱还原糖含量的影响

甜面酱中的还原糖主要来自原料中多糖的水解，一方面可以赋予甜面酱滋味，另一方面在保温发酵过程中参与美拉德反应而赋予甜面酱“酱色”，此外，还原糖还是保温发酵过程中微生物生长的重要碳源。

加入酵母后甜面酱中的还原糖含量呈明显下降趋势，见图1。无论酵母的接种顺序如何，当两种酵母添加比例为1∶1时，其还原糖含量均比其他组低。说明两种酵母添加比例为1∶1的添加方式更有利于两种菌利用甜面酱中的还原糖代谢产生其他物质。而A组的还原糖含量总体较G组与S组的还原糖含量更低，表明先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母的顺序更有利于两种酵母菌利用甜面酱中的还原糖。在发酵结束第45天，A2组中还原糖含量为所有样品中最低（20.02 g/100 g），即先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母且两种酵母添加比例为1∶1的添加方式能使两种酵母更好地利用甜面酱酱醪中的还原糖，以生成其他风味成分。

总酸和有机酸含量对甜面酱柔和口感的形成亦十分重要。由圖2可知，在发酵过程中，总酸含量均随发酵时间的延长而逐渐升高，两种酵母添加比例为1∶1（A2、G2、S2）更有利于甜面酱中酸类物质的产生。A组中所有样品的总酸含量均较G组与S组高，表明先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母的顺序有利于甜面酱总酸的产生。在发酵终端第45天，A2组总酸含量为9组中最高，达2.21 g/100 g。

由表2可知，当发酵结束后，有机酸含量最高的为A2 组（5.61 mg/g），且A组整体的有机酸含量相对于G组和S组更高，说明两种酵母按1∶1的比例添加更有利于甜面酱有机酸的合成，而除S2低于S1外，另外两组样品中A1、A3低于A2， G1、G3低于G2，说明先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母的顺序更有利于甜面酱有机酸的合成。

在9组甜面酱中均检测出7种有机酸，其中柠檬酸含量最高，尤其在A2组中达到2.52 mg/g；其次为乙酸，同样在A2组中含量最高，达1.43 mg/g，柠檬酸富有水果香气，乙酸则可以调和甜面酱的口感和风味。各种有机酸的组成为甜面酱提供了更加丰富的风味。

2.3 不同酵母接种方式对甜面酱氨基酸态氮含量的影响

氨基酸态氮是酱制品的重要指标之一，其含量与酱制品的滋味密切相关，同时还可以与还原糖发生褐变反应，形成“酱色”[20]。

由图3可知，9组甜面酱样品中氨基酸态氮的含量变化趋势基本一致，在整个发酵过程中逐渐上升，尤其前35 d上升趋势明显，主要是因为米曲霉与酵母的酶共同作用将蛋白质原料快速分解，生成大量氨基酸态氮。而40 d后酶活力降低，在氨基酸态氮生成速率降低的同时，美拉德反应和微生物代谢继续消耗氮源，造成氨基酸态氮生成速率和消耗速率达成平衡，所以其含量在后期趋于平稳。

两种酵母添加比例为1∶1（A2、G2、S2）更有利于甜面酱中氨基酸态氮物质的积累。而A组中所有样品的氨基酸态氮含量均较G组与S组高，表明先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母的添加顺序有利于甜面酱中氨基酸态氮的产生。在发酵终端第45天，A2组为9组中氨基酸态氮含量最高的，为0.49 g/100 g，即先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母且两种酵母添加比例为1∶1更利于甜面酱积累氨基酸态氮。

2.4 不同酵母接种方式对甜面酱挥发性风味成分的影响

不同种类酵母发酵所产生的风味物质种类和含量各不相同，利用 HS-SPME-GC/MS测定9组甜面酱样品中的挥发性风味物质，结果见表3。

由表3可知，9组甜面酱样品中共鉴定出49种挥发性风味成分，其中共有的挥发性风味物质包含27种。检测出的挥发性风味物质主要包括酸类、醇类、酯类、醛类、酮类、烃类以及一些其他杂环类化合物或芳香族化合物，其中，酸类物质含量占比为5.31%～9.50%，醇类物质含量占比为30.78%～35.15%，酯类物质含量占比为3.84%～5.48%，醛类物质含量占比为36.41%～40.42%，酮类物质含量占比为12.14%～15.34%，其他成分含量占比为0.72%～4.03%，即醛类挥发性风味物质含量最多，醇类次之。从挥发性风味物质的种类和含量来看，A组样品中的风味成分种类较G组和S组多，含量也更高，添加比例为1∶1时，挥发性风味成分的种类和含量更高。挥发性风味成分绝对含量最高的为A2组，达到84.36×10-2μg/g，最低的为G3组，达到47.70×10-2μg/g。

由图4可知，通过主成分分析（PCA），两个主成分PC1和PC2解释了总方差的58.6%（分别为43.4%和15.2%），表明样品在两个主成分上均发生分离，并且同组别中的平行样本呈现明显的聚拢趋势。说明不同酵母添加方式和添加比例对风味成分的影响较大。对3种不同甜面酱样品风味成分的积累模式差异通过聚类热图进行显示，见图5。

结果表明，在不同组别中，48种物质有明显差异，其中A2组风味成分种类最多，含量也最高，包括5-四氢呋喃-2-羧酸乙酯、3，3-二甲基-正己烷、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、5-甲基-庚酮、苯乙醛、苯甲醛、1-辛烯-3-醇等成分。这表明先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母且两种菌添加比例为1∶1时，甜面酱的风味成分种类更多，含量更高，说明该接种方式更有利于甜面酱风味的形成。

3 结论

对比甜面酱保温发酵过程中不同耐盐产香酵母的添加方式和添加比例，结果表明，先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母且二者比例为1∶1时更有利于氨基酸态氮和有机酸的积累。对挥发性风味成分而言，甜面酱样品中醛类、醇类、酮类的相对含量占比前三。当两种菌的添加比例为1∶1时，对甜面酱挥发性风味物质的产生更有利。其中，挥发性风味成分种类和数量最多的为A2组，共45种，含量达84.36×10-2 μg/g，最少的为G3组，共30种，含量为47.70×10-2 μg/g。以上结果表明，先添加鲁氏酵母后添加异常威克汉姆酵母且两种酵母添加比例为1∶1时时更有利于甜面酱品质和风味的提升。

参考文献：

[1]贠建民，张卫兵，赵连彪.调味品加工工艺与配方[M].北京：化学工业出版社，2007.

[2]蔡愈杭，王小曼.甜面醬生产新工艺研究[J].中国酿造，2013（6）：122-124.

[3]马新村.甜面酱酿制技术[J].中国调味品，2001（8）：28-30.

[4]周琳.浓香型高色度甜面酱加工技术及其新产品的开发[D].成都：成都大学，2020.

[5]刘达玉，刘阳，邓静，等.自然发酵甜面酱中芽孢杆菌的分离、筛选及鉴定[J].中国调味品，2018，43（10）：5-10.

[6]ZHANG Y Y， HUANG M Q， TIAN H Y， et al. Preparation and aroma analysis of Chinese traditional fermented flour paste[J].Food Science & Biotechnology，2014，23（1）：49-58.

[7]YU Q H， LI Y C， WU B， et al.Novel mutagenesis and screening technologies for food microorganisms：advances and prospects[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104（4）：1517-1531.

[8]金华勇.甜面酱发酵工艺试验研究[D].武汉：湖北工业大学，2009.

[9]余丹，毛娉，宋颀，等.基于高通量测序的传统甜面酱自然发酵过程中的微生物群落结构及其动态演替[J].微生物学通报，2018，45（5）：1061-1072.

[10]刘琨，但晓容，李栋钢.酵母菌在四川保温甜面酱品质提升中的应用研究[J].中国调味品，2016，41（6）：65-68.

[11]叶碧霞，左勇，赖琳，等.甜面酱保温发酵过程中微生物的研究[J].中国调味品，2017，42（4）：80-84.

[12]石娇娇，邓静，吴华昌，等.自然发酵甜面酱中生香酵母的鉴定及发酵代谢产物的研究[J].中国调味品，2014，39（12）：11-14.

[13]SCHERMERS F， DUFFUS J， MACLEOD A. Studies on yeast esterase[J].Journal of the Institute of Brewing，2013，82（3）：170-174.

[14]付雯.多菌种耦合发酵甜面酱工艺研究[D].武汉：湖北工业大学，2011.

[15]ZHANG L， HUANG J， ZHOU R Q， et al. The effects of different co-culture patterns with salt-tolerant yeast strains on the microbial community and metabolites of soy sauce moromi[J].Food Research International，2021，150：110747.

[16]王从从，石磊，万守朋，等.不同酵母种类及添加方式对甜面酱风味的影响[J].食品研究与开发，2018，39（6）：115-122.

[17]孟凡冰，王中伟，李云成，等.酱曲中耐盐产香酵母的分离及其发酵特性[J].食品科学，2020，41（24）：31-38.

[18]LI Y C， RAO J W， MENG F B， et al. Combination of mutagenesis and adaptive evolution to engineer salt-tolerant and aroma-producing yeast for soy sauce fermentation[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2021，101（10）：4288-4297.

[19]王沛.甜面酱的风味提升工艺研究[D].天津：天津科技大学，2020.

[20]左勇，叶碧霞，杨小龙，等.甜面酱保温发酵过程中挥发性成分的动态变化[J].食品工业科技，2016，37（19）：314-319.