肉桂精油纳米乳的制备及抗菌活性研究

赵电波 王少丹 王雯雯

摘要：肉桂精油具有良好的抗菌和抗氧化特性，由于存在挥发性强、水溶性差等问题，制约了其在食品保鲜领域的应用。研究证实，纳米乳化技术能够有效提高精油的水溶性及稳定性。文章以壳聚糖与果胶为壁材制备肉桂精油纳米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON），并评价了其抗菌活性。结果表明，超声波法制备CON的最优参数：肉桂精油添加量为1%～2%，壳聚糖与果胶的体积比为1∶1，超声波处理时间为7.5 min，超声波功率为450 W；制备的纳米乳粒径分布在10～150 nm，分散性及稳定性最好；CON对大肠杆菌O157： H7（Escherichia coli O157：H7）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和假单胞菌CM2（P. deceptionensis CM2）的最小抑菌浓度分别为0.500，0.250，0.125 μL/mL，表明CON具有较好的抑菌活性。该研究结果将为CON在食品保鲜中的应用提供理论依据和技术支撑。

关键词：肉桂精油；纳米乳；制备；抗菌活性

中图分类号：TS201.1      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0194-06

Abstract： Cinnamon essential oil has excellent antibacterial and antioxidant properties. The application of cinnamon essential oil in the field of food preservation is restricted because of its strong volatility and poor water solubility. Studies have confirmed that nano emulsification technology could effectively improve the water solubility and stability of essential oil. In this paper， cinnamon essential oil nanoemulsion （CON） is prepared with chitosan and pectin as the wall materials， and its antibacterial activity is evaluated. The results show that the optimal parameters for preparing CON by ultrasonic method are as follows： the addition amount of cinnamon essential oil is 1%～2%， the volume ratio of chitosan to pectin is 1∶1， the ultrasonic treatment time is 7.5 min， and the ultrasonic power is 450 W. The particle size distribution of the prepared nanoemulsion is 10～150 nm with the best dispersivity and stability. The minimum inhibitory concentrations of CON against Escherichia coli O157：H7， Listeria monocytogenes and P. deceptionensis CM2 are 0.500， 0.250， 0.125 μL/mL respectively， indicating that CON has good antibacterial activity. The results will provide theoretical basis and technical support for the application of CON in food preservation.

Key words： cinnamon essential oil; nanoemulsion; preparation; antibacterial activity

植物精油（essential oil，EO）是一種来源广泛、安全环保、不易产生耐药性的天然抗菌剂[1－2]。常见的植物精油包括肉桂精油、牛至精油、丁香精油、孜然精油等[3]。肉桂精油（cinnamon essential oil，CEO）因具有广谱抑菌性和抗氧化性，在食品保鲜领域的应用受到广泛关注。但由于肉桂精油不溶于水、挥发性强且稳定性较差，在一定程度上制约了其在食品中的应用[4]。近年来，利用纳米乳液包埋精油并应用于食品的抗菌保鲜已有许多报道。精油纳米乳不仅可以提高精油的稳定性，减少其刺激性气味，而且可以控制其释放速率，延长作用时间[5]。制备精油纳米乳的方法有很多，较为常见的是采用壳聚糖、果糖、明胶和黄原胶等多糖基载体对精油进行包埋[6]。例如，Huang等[7]采用高压均质法以明胶和壳聚糖溶液为壁材，以迷迭香提取物和ε-聚赖氨酸为芯材，制备了一种水包油型复合纳米乳，经纳米乳涂膜处理后，即食烧鸡的货架期与未处理组相比显著延长6 d。Liu等[8]采用高速剪切技术制备了薄荷精油纳米乳，通过条件优化确定最佳纳米乳配方为薄荷精油10%、表面活性剂8%、去离子水82%（质量比）。

目前，已有研究报道采用超声波法制备香茅精油[9]、牛至精油[10]和亚麻籽油[11]纳米乳，但鲜有报道采用超声波法制备多糖基肉桂精油纳米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON）。壳聚糖和果胶是天然的碱性多糖，无毒无害，具有良好的生物相容性和可降解性[12－13]。因此，本研究选用壳聚糖和果胶作为载体包埋肉桂精油制备纳米乳，探究两种多糖的添加量对CON稳定性的影响并对其进行表征及抗菌活性研究，旨在制备稳定性良好且抑菌性强的CON，并为其应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）：中国工业微生物菌种保藏管理中心；假单胞菌CM2（Pseudomonas deceptionensis CM2）菌株：由本实验室分离自腐败鸡肉；壳聚糖、果胶、肉桂精油：上海源叶生物科技有限公司；营养琼脂（nutrient agar，NA）、营养肉汤（nutrient broth，NB）：北京路桥技术有限责任公司；Tween 80、无水乙醇、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、冰乙酸：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器设备

Centrifuge 5424R型低溫高速离心机 德国Eppendorf公司；SHP-250型生化培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；Discovery HR-1型旋转流变仪 美国Waring公司；SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；VC750型超声波破碎仪 美国Sonic公司； Ultraturrax T25型高速分散器 德国IKA公司；MQD-S2R型全温振荡培养箱 上海旻泉仪器有限公司；Bioscreen C型全自动微生物生长曲线系统 芬兰Oy Growth Curves Ab公司；Turbiscan Lab Measuring Expert型多重光散射仪 法国Formulaction仪器公司；Nano-ZS90型纳米激光粒度仪 英国Malvern仪器公司；SevenGo Duo型pH计 瑞士Mettler Toledo仪器有限公司；Tecan Spark 20M型多功能微孔板读数仪 瑞士Tecan公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液制备

用无菌接种环分别挑取活力旺盛的E. coli O157：H7、L. monocytogenes和P. deceptionensis CM2单菌落接种于NB培养基中，于30～37 ℃、150 r/min摇床中恒温振荡培养12 h。取25 mL培养物于50 mL离心管中，离心（4 ℃，8 000×g，10 min），弃上清液，收集菌体。用无菌NaCl溶液（0.90%，质量和体积比）洗涤菌体2次，离心同上。将所得菌体重悬于磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）中，混匀，测量菌悬液的OD600值，调整OD600值介于1.2～1.4之间，制成活菌数约为8 lg CFU/mL的菌悬液备用。

1.3.2 CON的制备

参考He等[14]的方法并适当改进。称取0.6 g壳聚糖粉末溶于100 mL乙酸溶液（0.5%，体积比）中，室温下磁力搅拌2 h得到壳聚糖溶液（0.6%，质量和体积比）。称取1.0 g果胶粉末溶于100 mL蒸馏水中，室温下磁力搅拌2 h得到果胶溶液（1%，质量和体积比）。将壳聚糖溶液和果胶溶液按一定的体积比混合，作为乳液基质，然后将肉桂精油加入基质溶液中，再加入吐温80作为乳化剂，吐温80与精油的比例为1∶4，磁力搅拌20 min至分散均匀，然后用高速均质机在10 000 r/min条件下均质2 min，形成粗乳液。通过超声波设备进一步均质乳化即得CON，于4 ℃冷藏备用。

1.3.3 CON制备条件优化

对壳聚糖和果胶的不同比例、超声功率和超声时间对CON性质的影响进行分析，通过测定CON的平均粒径、多分散性指数（polydispersity index，PDI）、Zeta-电位、Turbiscan稳定性指数（Turbiscan stability index，TSI）、黏度等确定制备壳聚糖-果胶基CON的最优条件。

1.3.3.1 壳聚糖和果胶的比例

根据前期预试验结果，将壳聚糖溶液和果胶溶液分别按0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、1∶4（体积比）混合，然后将肉桂精油（1.5%，体积比）和吐温80加入到不同比例的壳聚糖和果胶溶液中，吐温80与精油的比例为1∶4（体积比），磁力搅拌20 min至分散均匀。用高速均质机在10 000 r/min下均质2 min，形成粗乳液。再采用超声波设备（功率为450 W，时间为5 min，频率为20 Hz）进一步均质乳化得到CON。分别测定CON的pH、粒径、ζ-电位、流变特性（黏度）以及TSI。

1.3.3.2 超声波功率

将壳聚糖溶液和果胶溶液按1∶1（体积比）混合，然后将肉桂精油（1.5%，体积比）和吐温80加入到基质溶液中，吐温80与精油的比例为1∶4，磁力搅拌20 min至分散均匀。用高速均质机在10 000 r/min下均质2 min，形成粗乳液。再采用不同功率（0，150，300，450，600，750 W）的超声波设备（频率为20 Hz，时间为5 min）进一步均质乳化即得CON。测定CON的平均粒径和PDI。

1.3.3.3 超声波处理时间

将壳聚糖溶液和果胶溶液按1∶1（体积比）混合，然后将肉桂精油（1.5%，体积比）和吐温80加入到基质溶液中，吐温80与精油的比例为1∶4，磁力搅拌20 min至分散均匀。用高速均质机在10 000 r/min下均质2 min，形成粗乳液。再采用超声波设备（频率为20 Hz，功率为450 W）进一步均质乳化，处理时间分别为0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 min，得到CON。测定CON的平均粒径和PDI。

1.3.3.4 肉桂精油添加量

将壳聚糖溶液和果胶溶液按1∶1（体积比）混合，然后将肉桂精油（浓度分别为0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%）和吐温80加入到基质溶液中，吐温80与精油的比例为1∶4，磁力搅拌20 min至分散均匀。用高速均质机在10 000 r/min下均质2 min，形成粗乳液。再采用超声波设备（频率为20 Hz，功率为450 W，时间为7.5 min）进一步均质乳化，得到CON。测定CON的平均粒径和PDI。

1.3.4 pH的测定

采用SevenGo Duo型pH计测量CON的pH值。

1.3.5 平均粒径、PDI和Zeta-电位的测定

用Nano-ZS90纳米激光粒度仪测量CON的平均粒径、PDI和Zeta-电位。取1 mL制备好的CON加入样品槽中，平衡时间为2 min。

1.3.6 TSI的测定

参考Wang等[15]的测定方法，采用多重光散射仪测定CON的TSI值。取20 mL CON置于玻璃瓶中，确保无气泡，在25 ℃下进行稳定性分析测试。每隔30 s扫描一次，总扫描时间为60 min。利用Turbiscan软件进行数据处理，得出样品的TSI值。

1.3.7 黏度的测定

参考李可等[16]的方法并适当修改，采用流变仪测定CON的黏度。取3 mL不同比例的壳聚糖和果胶制备的CON样品均匀涂布于测试平台上，用硅胶油密封以防止水分蒸发。测试温度为25 ℃，夹缝间隙为1 mm，剪切速率为1～200 s-1。

1.3.8 抗菌活性的测定

采用抑菌圈法测定CON对E. coli O157：H7的抗菌活性。参考Kazempour-Samak等[17]的方法，将无菌圆滤纸片（d=8 mm）置于涂布了E. coli O157：H7菌液（浓度约为8 lg CFU/mL）的平板上，每个平板上放3片圆滤纸片，依次将10 μL的壳聚糖-果胶基质溶液、粗乳液和CON（浓度为1%）垂直滴加到圆滤纸片上。将平板置于37 ℃培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈的直径。

1.3.9 MIC和MBC的测定

采用二倍稀释法测定CON的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）。参考Du等[18]的方法并适当修改，在96孔细胞培养板的前三排每孔各加入100 μL NB培养基，然后在每排第1孔中加入100 μL CON（稀释至肉桂精油浓度为8 μL/mL），用移液器吹打混匀后吸取100 μL混合溶液置于第2孔中，照此添加至第6孔，吸取第6孔中100 μL混合溶液弃去，然后在每孔中加入100 μL浓度约为6 lg CFU/mL的供试菌菌悬液，此时每孔CON中的肉桂精油浓度从左至右依次为2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.062 μL/mL。将96孔细胞培养板于30～37 ℃培养48 h，通过多功能微孔板读数仪观察供试菌的生长情况，以完全没有微生物生长的最低的肉桂精油浓度作为MIC。在测得MIC的基础上，吸取100 μL上述无微生物生长的孔中的液体培养基涂布于平板上，于30～37 ℃培养24～48 h，以平板上无菌落生长的最低的肉桂精油浓度作为MBC。

1.4 数据处理

每次试验均重复3次，试验结果表示为平均值±标准差。采用Prism软件（GraphPad 7.0）绘图，采用SPSS 24.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA），各组间采用LSD多重比较进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖和果胶的比例对肉桂精油纳米乳pH的影响

乳液的pH值在乳液体系的稳定性中起着重要作用[19]，壳聚糖和果胶的比例对肉桂精油纳米乳pH的影响见图1。

由图1可知，随着壳聚糖和果胶比例的增大，CON的pH在3.80～3.65之间（P>0.05），说明CON的pH较稳定。

2.2 壳聚糖和果胶的比例对CON粒径和电位的影响

乳液粒径的大小是评判纳米乳液是否形成的标准，也是反映乳液体系分散性及稳定性的重要指标。不同比例的壳聚糖与果胶对CON平均粒径的影响见图2中A。随着壳聚糖和果胶比例的增大，CON的平均粒径呈现先减小后增大的变化趋势。当壳聚糖与果胶的比例为1∶0时，CON的粒径最大，为40.21 nm；而当壳聚糖与果胶的比例为1∶1时，CON的粒径最小，为17.51 nm。

Zeta-电位反映了溶液中纳米粒子表面电荷之间的相互作用，是影响纳米乳液稳定性的重要参数之一，Zeta-电位绝对值越大，说明乳液体系越稳定[20]。由图2中B可知，壳聚糖与果胶的比例显著影响CON的Zeta-电位。单独添加壳聚糖时CON具有较高的正电位（+59 mV），而单独添加果胶时则为负电位（－3 mV），这主要是由壳聚糖和果胶自身所带电荷决定的。壳聚糖是阳离子多糖，分子含有带正电荷的氨基；而果胶是阴离子多糖，分子含有带负电荷的羧基[21]。Zeta-电位随着果胶添加量的增加而降低，这可能是由于壳聚糖和果胶之间相反的电荷发生了中和反应。当壳聚糖与果胶的比例为1∶1时，CON的Zeta-电位为+32 mV，乳液较稳定。综上，当壳聚糖与果胶的比例为1∶1时，CON的粒径最小，Zeta-电位值相对较大，稳定性较好。

2.3 壳聚糖和果胶的比例对CON流变特性和稳定性的影响

乳液黏度的变化反映了分子间力的变化，分子间相互作用力越强，乳液黏度越大[22]。由图3中A可知，在剪切速率范围（0～100 s-1）内，CON的黏度随着剪切速率的增加先迅速下降后趋于平缓，出现剪切稀化现象，表现为假塑性流体，这与王忠琨等[23]的研究结果基本一致。此外，CON的流变特性受果胶添加量的影响，果胶添加量越多，黏度越大，壳聚糖与果胶的比例为1∶0时，CON黏度最小，其次是1∶1。一般情况下，黏度越小，说明CON越均匀细腻，流动性越强。

乳液在放置过程中可能会出现乳析、絮凝或聚结等情况，TSI可以评价乳液的稳定性，一般来说，TSI曲线斜率和数值越小表示乳液发生分离的速度越慢，乳液稳定性越好；TSI越大，乳液穩定性越差[24]。由图3中B可知，CON的TSI值随着时间的延长呈现不断增加的趋势，说明在1 h内纳米乳液的稳定性不断下降。当壳聚糖与果胶的比例为0∶1时，TSI值在1 h内急剧升高，说明此比例下乳液极不稳定；壳聚糖与果胶的比例为1∶1时，CON的TSI值最低，说明在该比例下CON的稳定性最好。

2.4 超声功率和超声时间对CON粒径和PDI的影响

超声波可用于制备具有小液滴尺寸和高稳定性的纳米乳[25]。由图4中A可知，与未超声处理组相比，超声处理组CON的粒径更小，分散性更好。随着超声功率从0 W增加到450 W，乳液粒径从210.83 nm减小到24.03 nm；而超声功率从450 W增加到750 W，乳液粒径增加到34.60 nm。PDI是聚合物相对分子质量分布宽度的量度，PDI值越小说明乳液体系越均匀[26]。随着超声功率从0 W增加到450 W，PDI从0.63减小至0.48；而从450 W增加到750 W，PDI增加至0.54。以上结果表明，经功率为450 W的超声波处理后，CON粒径较小，分散性较好。由图4中B可知，CON的平均粒径和PDI随着超声时间的延长均呈现先减小后增大的趋势，在7.5 min时达到最小值。这可能是因为超声波处理可以将乳液中的大颗粒破碎成细小的微粒，乳液粒径降低，从而使其分散性更好，而超声时间过长会导致物质重新发生聚集，使其粒径增大，这与Shao等[27]的研究结果一致。当超声时间为10 min时，平均粒径和PDI值的变化与7.5 min相比差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明，经7.5 min的超声波处理后，纳米乳液能达到较稳定的状态。因此，综合考虑，确定最佳的超声功率为450 W，超声时间为7.5 min。

2.5 肉桂精油添加量对CON粒径、PDI和电位的影响

由表1可知，随着肉桂精油添加量的增加，纳米乳的粒径不断变小，当添加量为0.25%时，粒径为259.00 nm，而当添加量增加至2%时，粒径降低至19.74 nm，可能是因为精油添加量的增加增强了乳液界面膜的稳定性和聚结力，这与Sun等[28]的研究结果一致。PDI值之间无显著差异（P>0.05）。此外，Zeta-电位值随着精油添加量的增加而不断增加，当精油添加量在1%～2%之间时，CON的Zeta-电位均大于30 mV，说明乳液较稳定。综上所述，肉桂精油添加量为1%～2%时，CON粒径较小且稳定性较好。

2.6 CON与粗乳液抗菌活性对比

采用琼脂滤纸片扩散法评价CON、粗乳液和多糖基质的抑菌活性。由图5可知，抑菌圈直径的大小依次为纳米乳液>粗乳液>多糖基质，说明CON的抗菌活性优于粗乳液和多糖基质，这与蒋书歌[29]的研究结果一致。可能是因为CON粒径小且均一性高，使精油能够更好地释放，从而发挥更强的抑菌效果。

2.7 CON的抗菌活性

由表2可知，CON对E. coli O157：H7、 L. monocytogenes和P. deceptionensis CM2的MIC为0.125～0.500 μL/mL，MBC为0.250～0.500 μL/mL。在3种测试菌株中，纳米乳对P. deceptionensis CM2的抗菌活性最强，L. monocytogenes次之，E. coli O157：H7最弱，可能是由于不同菌株之间细胞壁和细胞膜的结构和组成存在较大差异，这与王雪薇[30]的研究结果基本一致。

3 结论与讨论

综上所述，采用超声波法制备CON的最优参数为壳聚糖与果胶的体积比1∶1、超声时间7.5 min、超声功率450 W、肉桂精油体积分数1%～2%，在该条件下CON的平均粒径主要分布在10～150 nm，Zeta-电位绝對值大于30 mV。通过抑菌圈对比，证明了CON的抑菌效果优于粗乳液和多糖基质，且CON对不同的测试菌株均具有较好的抑菌活性。在今后的研究中应综合运用代谢组学、蛋白质组学、转录组学等方法系统阐明CON失活微生物的作用机制；此外，还应系统评价CON对食品表面微生物的抑制效果及对食品营养、感官及货架期等指标的影响。

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