响应面法优化百香果果醋澄清的酶解工艺

卢珍兰 庞永慧 庞情 李致宝

摘要：从蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶4种酶中筛选出2种酶进行复合，对百香果果醋进行澄清处理，以百香果果醋透光率为参考指标，通过响应面法优化百香果果醋澄清的酶解工艺。结果表明，百香果果醋澄清的酶解工艺响应面模型的建立具有稳定性，最适澄清酶解工艺条件为复合酶配比（淀粉酶∶果胶酶）3∶2、复合酶添加量145 mg/kg、澄清温度46.5 ℃、澄清时间125 min。在此优化工艺参数下，百香果果醋透光率可达85.7%，与原醋相比提高了27%，澄清后的百香果果醋外观呈浅黄色，色泽透亮清澈，无肉眼可见杂质。

关键词：百香果；果醋；复合酶澄清剂；响应面；透光率

中图分类号：TS275.4      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0137-06

Abstract： Two enzymes are selected from the four enzymes of protease， amylase， pectinase and glucoamylase， and compounded to clarify the passion fruit vinegar. Taking the light transmittance of passion fruit vinegar as the reference index， the enzymatic hydrolysis process for clarification of passion fruit vinegar is optimized by response surface methodology. The results show that the establishment of response surface model of enzymatic hydrolysis process for clarification of passion fruit vinegar is stable， and the optimum enzymatic hydrolysis process conditions for clarification are as follows： the ratio of compound enzymes （amylase∶pectinase） is 3∶2， the addition amount of compound enzymes is 145 mg/kg， the clarification temperature is 46.5 ℃， and the clarification time is 125 min. Under the optimized process parameters， the light transmittance of passion fruit vinegar can reach 85.7%， which is 27% higher than that of the original vinegar. The clarified passion fruit vinegar has light yellow appearance， bright and clear color， and no visible impurities.

Key words： passion fruit; fruit vinegar; compound enzyme clarifier; response surface; light transmittance

百香果又称为鸡蛋果、巴西果[1]，是西番莲科西番莲属多年生草质藤本植物[2-3]，学名西番莲，属于较受欢迎的一种保健养生水果[4-5]。百香果的果肉可以提供人体不可或缺的营养素，如矿物质、维生素、蛋白质，而且含有丰富的次级代谢产物，其主要成分为黄酮类物质[6]。黄酮类物质既可以抑制或清除机体内过多的游离自由基，又能防止氧化、延缓衰老，使机体持续保持良好的健康活力状态[7]。百香果鲜果水分含量高，成熟后容易腐烂，不适合长期贮存运输，所以将其加工成果醋是最常见的百香果深加工方式之一。百香果果醋中含有醋酸、生物碱、黄酮、花青素、氨基酸、植物甾醇和维生素等多种生物活性成分，这些成分对促进人体的健康大有益处[8]。由于果醋含有蛋白质、高分子碳水化合物和果胶等物质，在投放市场期间，随着运输和环境条件的改变，果醋会出现颜色变深暗、反浑等现象，这不仅影响了果醋的外观和感官体验[9]，而且在一定程度上影响了果醋的食用价值和市场销售[10]。

酶澄清法（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、糖化酶）是国内外常用于水果加工行业的澄清方法之一[11]，尤其是在果醋行业，澄清出的果醋品质更好，风味更佳。因此，本试验选用百香果全果为原料进行果醋发酵，在单因素试验的基础上运用响应面法对果醋澄清工艺条件进行优化，旨在获得百香果果醋澄清的最佳工艺参数，并对果醋产品的理化指标和稳定性进行测定与研究，探究食品酶制剂对果醋澄清处理的效果，解决因沉淀、浑浊等现象而造成的资源浪费问题。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

紫皮百香果（原料）：市售；白砂糖：昆明多悦多工贸有限公司；果酒专用安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；果醋发酵用菌：烟台帝伯仕酵母有限公司；纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶：河南万邦实业有限公司；测定指标用的化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

YS-002多功能破壁养生料理机 深圳市龙华区金尼熊电器厂；GHP-9050恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；BSA24S电子分析天平 德国赛多利斯科学仪器有限公司；PAL-1数显糖度计 广州市爱拓科技有限公司；ATC酒精计 广东省深圳市启振仪器有限公司；IS28C pH计 上海仪迈仪器科技有限公司；H1650台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH-S6数显恒温水浴锅 江苏金怡仪器科技有限公司；UV-1601紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 百香果果醋的发酵澄清工艺流程

新鲜百香果→筛选、清洗→破碎、打浆→纤维素酶、果胶酶酶解→糖酸调整→装罐→灭菌→冷却→酵母活化→接种酵母→酒精发酵→酒渣分离→粗过滤→果酒→蒸馏水调节酒精度→果酒杀菌→冷却→醋酸菌活化→接种醋酸菌→醋酸发酵→果醋→过滤、杀菌→加入复合酶澄清剂→酶解→冷却离心→测透光率→稳定性研究。

1.3.2 操作要点

原料：选择八成熟、外观良好无腐烂的新鲜果，本试验用紫皮百香果。

制备果浆：百香果去柄，冲洗干净后，按百香果与水的质量比为1∶3进行打浆[12]，然后酶解处理的酶用量为果浆质量的0.12%，纤维素酶与果胶酶的比例为5∶1，在50 ℃条件下酶解3.5 h。

灭菌：用糖液调节初始糖度后65 ℃灭菌0.5 h，冷却到室温。

酵母活化：用无菌水溶解酵母后置于32 ℃恒温水浴锅中活化0.5 h。

酒精发酵：酵母活化好后，接种到发酵液中，置于30 ℃恒温发酵箱中恒温发酵7 d，发酵过程中定期排气。

醋酸发酵：从发酵好的果酒中取上清液，用蒸馏水稀释，调节酒精度为8％，糖度为6.5％，称取一定质量的果酒于冷却杀菌的罐子中，杀菌，冷却后接种醋酸菌，醋酸菌接种量为8%，用纱布盖住瓶口，室温发酵，每天摇动1～2次，发酵时间为9 d，过滤，于65 ℃水浴锅中静置0.5 h，进行终止发酵处理，杀菌，冷却，即得到果醋粗成品。

澄清酶筛选：取果醋粗成品，分别加入蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶对果醋进行澄清处理，测透光率，透光率越高表明百香果果醋的澄清效果越好[13]，根据试验结果选出效果较好的两种酶。

复合酶澄清：将筛选出的两种酶进行复合，探究复合酶配比、复合酶添加量、澄清温度和澄清时间4个因素对透光率的影响。

响应面优化：根据得出的单因素试验结果结合响应面优化法研究百香果果醋的酶解澄清工艺。

1.3.3 百香果果醋澄清剂筛选

单一酶澄清剂的筛选见表1。以蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶作为澄清剂对百香果果醋进行澄清试验，酶添加量、澄清温度、澄清时间均选取各自最适处理工艺，经4 000 r/min离心15 min后，取澄清液，在750 nm处测透光率，做3组平行试验取平均值，从中选出2组试验结果较好的酶作为复合酶澄清剂进行下一步的试验。

1.3.4 复合酶澄清条件优化单因素试验

根据百香果果醋澄清剂筛选的结果，选出对透光率影响较大的两种酶进行复合酶澄清试验，对果醋进行澄清处理，探究复合酶配比、复合酶添加量、澄清温度和澄清时间4个因素对澄清效果的影响。

1.3.4.1 复合酶配比筛选

复合酶配比（质量比）按混合比1∶3、1∶2、3∶2、2∶1、3∶1，总添加量为150 mg/kg加入到一定量的百香果果醋中混合均匀，在40 ℃下恒温水浴酶解90 min，澄清结束后进行灭酶，冷却后4 000 r/min 离心15 min，取澄清液在750 nm处测其透光率，确定复合酶澄清剂最佳配比。

1.3.4.2 复合酶添加量

以复合酶配比3∶2，复合酶添加量按照90，120，150，180，210 mg/kg加入到一定量的果醋中，使其充分混合，在40 ℃下恒溫水浴酶解90 min，澄清结束后进行灭酶，冷却离心，取澄清液测其透光率，确定最佳复合酶添加量。

1.3.4.3 澄清温度

以复合酶配比3∶2，总添加量150 mg/kg加入到一定量的果醋中混合均匀，分别在30，35，40，45，50 ℃下恒温水浴酶解90 min，澄清结束后进行灭酶，冷却离心，取澄清液测其透光率，确定最佳澄清温度。

1.3.4.4 澄清时间

以复合酶配比3∶2，总添加量150 mg/kg加入到一定量的果醋中混合均匀，在45 ℃恒温水浴酶解30，60，90，120，150 min，澄清结束后进行灭酶，冷却离心，取澄清液测其透光率，确定最佳澄清时间。

1.3.5 响应面优化试验

采用Box-Behnken试验设计进一步优化单因素的取值和交互作用对响应值的影响，根据单因素试验的结果，以复合酶配比（A）、复合酶添加量（B）、澄清温度（C）和澄清时间（D）为自变量，以百香果果醋的透光率（Y）为响应值，探究果醋澄清的最优工艺参数。响应面试验设计因素和水平见表2。

1.4 稳定性研究

碘试验：取澄清后的果醋5 mL，加入10 g/L的碘液1 mL，混合均匀后，观察醋体颜色是否变蓝；醇试验：取澄清后的果醋5 mL，加入95%的乙醇10 mL，混合，静置2 d，观察醋体中是否有絮状物或沉淀形成；热处理：取澄清液50 mL，置于55 ℃水浴锅中0.5 h，取出后迅速放入冷水中冷却1 h，室温静置2 h和7 d，测其透光率。

1.5 理化指标检测

可溶性固形物含量采用数显糖度计测定，总酸含量采用GB/T 12456－2008《食品中总酸的测定》测定，氨基酸态氮采用GB/T 12143－2008《饮料通用分析方法》测定。

1.6 数据处理

试验数据采用WPS Office自带的软件进行绘图处理以及使用Design-Expert 12软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 百香果果醋澄清剂筛选

由图1可知，4种酶均对百香果果醋澄清有一定的澄清效果，试验2号、试验3号的效果最好，即淀粉酶、果胶酶对果醋的澄清效果最好，透光率分别为80.3%、79.8%；试验1号的效果最差，即蛋白酶对果醋的澄清效果最差，透光率仅为66.5%，所以选择淀粉酶和果胶酶作为复合酶对果醋进行澄清处理。

2.2 复合酶澄清剂对百香果果醋澄清效果影响的单因素试验

2.2.1 不同复合酶澄清剂配比对澄清效果的影响

由图2可知，当复合酶配比（淀粉酶∶果胶酶）在1∶3～3∶2之间时，果醋的透光率随着配比的增大而增大，比例超过3∶2时，透光率逐渐下降，即在3∶2时达到最大值，为80.6%。说明适宜的复合酶配比对果醋的澄清有较好的作用效果，但随着复合酶配比的继续增大，透光率出现逐渐下降的趋势，原因可能是复合酶配比的增大使复合酶在较短的时间内达到了酶分子之前的平衡点，而当超过这个平衡点时，酶分子与酶分子之间不同电荷的浑浊物互相干扰，破坏了其互补效果，造成透光率下降，澄清效果不佳，根据结果选择复合酶配比为3∶2。

2.2.2 复合酶添加量对澄清效果的影响

由图3可知，复合酶添加量低于150 mg/kg时，果醋的透光率缓慢上升，当复合酶添加量为150 mg/kg时，果醋的透光率达79.9%，为最大值。当添加量高于150 mg/kg后，复合酶澄清的吸附能力过饱和，相应底物被完全水解后，导致酶蛋白残留过多，使果醋开始出现浑浊，胶体物质被部分沉淀，残留的复合酶在醋体中悬浮，因而使果醋产生浑浊，因此选择复合酶添加量為150 mg/kg。

2.2.3 澄清温度对澄清效果的影响

由图4可知，随着澄清温度的提高，透光率也相应增大，当澄清温度为45  ℃时，透光率达最大值，为84.6%，说明适宜的温度能提高酶的活性，使反应速度加快，进一步促进酶的作用，但温度大于45 ℃后，澄清温度超出一定的范围，即温度过高，酶会发生变性，导致酶活力丧失，造成果醋中含有的可溶性物质稳定性降低，从而使果醋出现浑浊，根据试验结果选择澄清温度为45 ℃。

2.2.4 澄清时间对澄清效果的影响

由图5可知，澄清时间在30～120 min范围内，随着澄清时间的递增，果醋的透光率也相应升高，当酶解时间为120 min时，透光率为81.7%，达到顶点。当澄清时间高于120 min后，透光率下降，这是因为酶解时间过长，导致部分酶失活，也有可能是复合酶与醋体中含有各类物质如酸类、醇类等发生一系列静电、沉降、分解等作用，导致其他悬浮颗粒沉淀下来，透光率随之下降，根据试验结果选择澄清时间为120 min。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面优化复合澄清条件

在复合酶澄清剂对百香果果醋进行澄清处理单因素试验的基础上，以复合酶配比（A）、复合酶添加量（B）、澄清温度（C）和澄清时间（D）为自变量，以百香果果醋的透光率（Y）为响应值，研究自变量及各因素间的交互作用对百香果果醋澄清效果的影响。百香果果醋响应面试验结果见表3。

采用 Design-Expert 12软件对表3中的数据进行多元回归方程拟合，获得回归方程：

Y=85.52+0.52A-0.83B+0.97C+0.84D-0.35AB+0.05AD+0.25BC+0.78BD-0.6CD-1.26A2-2.28B2-1.36C2-1.58D2。

为了检验方程的可行性，对百香果果醋透光率的模拟方程进行方差分析，结果见表4。

由表4可知，果醋透光率模型的P值<0.000 1，表明回归模型具有极显著性（P＜0.01），失拟项的P值为0.180 9，不显著，可得出试验所得模型可靠，具有较好的拟合性[14]。

模型的R2为0.952 8，决定系数RAdj2=0.905 6，证明该模型可以反映各因素之间的关系，拟合程度较高，试验误差小，可以很好地反映实际值，可以对百香果果醋澄清酶解的条件进行分析和预测。模拟项的A、B、C、D、A2、B2、C2、D2具有极显著性（P＜0.01），BD、CD达到显著性效果（P＜0.05），AB、AC、AD、BC对响应值的影响均不显著。F值越大，表明该因素对百香果果醋澄清效果的影响越显著[15]，由分析可得影响响应值的因素顺序由大到小为C（澄清温度）＞D（澄清时间）＞B（复合酶添加量）＞A（复合酶配比）。结果表明，澄清温度对果醋透光率的影响最大，澄清时间和复合酶添加量的影响次之，复合酶配比对果醋透光率的影响最小。

2.3.2 因素交互作用分析

RSM（响应面）模型能够直观、准确地描述两个因素之间的相互作用，表现不同因素对某一指标的影响。复合酶配比、复合酶添加量、澄清温度、澄清时间对果醋透光率的交互作用见图6。每两个因素在一个抛物线关系中相互影响，并且只有一个最优的RSM值。

由图6 可知，响应面图开口均向下，响应值随着因素水平的变化先增大，达到极点后开始逐渐减小，响应面具有最高点，证明该模型在此水平取值范围内存在稳定点。曲面弯曲的程度则说明单因素对响应值的影响是否显著，曲面越弯曲即坡度越陡，等高线呈椭圆形则影响越大，反之则影响不大[16]。图6中BD、CD两组澄清条件的交互作用显著，等高线图接近椭圆形，曲面斜率陡峭，说明两因素的交互作用对透光率的影响具有显著性；而AB、AC、AD、BC 4组澄清条件两两交互作用不明显，等高线图趋于圆形，即对果醋透光率的影响不大，这与表4中结果相吻合。

2.3.3 百香果果醋最佳澄清效果的条件验证试验

采用Design-Expert 12软件对数据进行响应面分析，复合酶澄清的最佳工艺参数：复合酶配比为3∶2，复合酶添加量为145.4 mg/kg，澄清温度为46.5 ℃，澄清时间为125.3 min，在最佳工艺条件下的百香果果醋透光率预测值为85.9%。为检验其是否合理，需进行试验验证，取复合酶配比 3∶2、复合酶添加量145 mg/kg、澄清温度46.5 ℃、澄清时间125 min进行验证，重复验证3次，取透光率平均值，得到百香果果醋透光率为85.7%。预测值与实测值吻合较好，表明模型方程可用于预测最优响应值。

2.4 稳定性研究

原醋与澄清醋做碘試验均不变色，不出现蓝色，原因可能是果醋本身虽含少量淀粉，但经过静置或澄清剂处理后可沉淀出淀粉。原醋与澄清醋经醇试验检验，原醋沉淀比较多，澄清醋沉淀较少，表明复合酶能有效地澄清百香果果醋。对澄清后的果醋进行热处理，使其因加热引起蛋白质变性而沉淀出来，并将加热后的果醋迅速放入冰水中冷却，以除去不稳定的胶体、沉淀物等，增强果醋的稳定性。试验结果表明，澄清醋热处理后放置2 h和7 d，透光率基本不变，虽略微上升，但上升幅度很小，说明经复合酶处理后的果醋稳定性较好，见表5。

2.5 理化指标

氨基酸态氮为0.16 g/dL；总酸（以醋酸计）为4.2 g/dL；可溶性固形物为3.0 °Brix。

3 结论

本试验以百香果全果为原料发酵制备果醋，以透光率为响应值，通过单因素试验和响应面试验确定果醋澄清的最佳工艺参数：复合酶配比为3∶2，复合酶添加量为145 mg/kg，澄清温度为46.5 ℃，澄清时间为125 min。在此最优工艺条件下，澄清后的果醋透光率达到85.7%。澄清处理后获得的百香果果醋饮品颜色呈浅黄色，醋液体均匀透亮，无肉眼可见杂质。

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