香叶木素对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

周金剑,杨 康

(武汉大学人民医院:1.麻醉科,2.泌尿外科,湖北武汉 430061)

肾缺血再灌注 (ischemia reperfusion,I/R)损伤是指肾组织短暂缺血后,恢复血供导致肾脏损伤程度加重的一种病理生理现象,临床中常见于肾部分切除以及肾移植等过程。肾 I/R损伤是肾小管和炎症细胞等多因素相互作用的炎症反应[1]。调控核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)作为一类重要的核转录因子,在体内主要参与调控炎症反应[2]。当肾脏发生I/R时,NF-κB信号通路关键蛋白P65将进入细胞核启动转录,并促进炎症因子高表达,参与调控炎症反应[2]。

香叶木素(3’,5,7-三羟基-4’-甲氧基黄酮)是一种从柑橘叶或橄榄叶中提取并抑制人CYP1A酶活力的天然黄酮类化合物,具有抑制肿瘤增殖、抗氧化应激的作用[3]。我国学者构建肥厚性心肌病小鼠模型,利用不同浓度香叶木素喂养小鼠,实验发现香叶木素通过激活P62/keap1/Nrf2信号通路改善小鼠压力超负荷致使的心脏肥大[3]。然而,香叶木素对肾I/R诱导急性肾损伤的作用和机制尚未完全阐明。在本研究中,笔者旨在探索香叶木素是否可以改善肾I/R对小鼠肾损伤的程度,并从动物水平探索香叶木素的保护作用以及其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物45只(7～9周龄,20～25 g)雄性BALB/c大鼠购自北京维通利华责任有限公司,动物饲养于恒温、恒湿SPF级动物房。本研究得到武汉大学人民医院动物伦理委员会批准,动物处置方法均符合动物伦理学规范。

1.2 分组及处理将小鼠随机分为假手术组(Sham组,n=15)、肾I/R组(I/R组,n=15),香叶木素治疗组(Dio组,n=15)。使用灭菌生理盐水稀释香叶木素,香叶木素治疗组小鼠造模14 d前开始给药(1 mg/kg),连续给药14 d,Sham组和I/R组使用灭菌的生理盐水作对照处理。14 d治疗后,对肾I/R组和香叶木素治疗组小鼠进行肾 I/R模型造模。

1.3 I/R模型的建立术前1 d小鼠禁食,不禁水。用体积分数为5%的戊巴比妥注射液采用腹腔内注射麻醉小鼠,待小鼠无法自我爬行时,分别剪去双侧背部毛发,纵向切开皮肤,分离筋膜、肌肉,暴露双侧肾蒂。双侧肾脏用无损伤显微动脉夹夹闭,30 min后恢复血供,逐层缝合切口,分别于术后48 h取材。从下腔静脉取血,利用心室生理盐水灌流至肾脏,待肾脏变白后肾脏取材。小心游离肾蒂,肾脏置于冰上,快速去除包膜,一半行多聚甲醛固定用于组织形态学染色,另一半速冻至液氮,转移至深低温冰箱,用于蛋白及分子生物学检测。

1.4 肾功能检测取小鼠眼球血,使用尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(creatinine,Cr)检测试剂盒(上海,速徕生物科技有限公司)按照厂家说明书,检测小鼠体内BUN和Cr水平变化。

1.5 HE染色将小鼠肾组织切片放入二甲苯脱蜡,再依次经梯度酒精复水,将其放入苏木精中染色2 min,立即用流水冲洗30 min去除浮色并蓝化,复染完成后,将切片依次放入梯度酒精中脱水,最后用二甲苯透明,中性树胶封片,晾干后在显微镜(400倍)观察并拍照。每只小鼠标本获取5～8个视野,根据每个视野肾小管上皮细胞扩张程度,红细胞、炎症细胞浸润范围进行肾小管损伤程度评分(0～4分)。1分:损伤视野<25%;2分:损伤视野<50%;3分:损伤视野<75%;4分:损伤视野>75%。邀请2位病理专业研究人员,每组小鼠随机抽取5个视野统计分析。

1.6 免疫组化染色将小鼠肾组织切片浸润二甲苯脱蜡,依次经梯度酒精复水,将pH=6.0的柠檬酸缓冲液在水浴锅中加热至95 ℃～100 ℃,然后把切片放入烧杯中,继续加热煮沸20～25 min后取出室温自然冷却;使用免疫组化试剂盒(福州,迈新生物技术开发有限公司)根据厂家说明书进行免疫组化检测。

1.7 免疫印迹技术采用RIPA试剂盒(武汉,塞维尔生物科技),根据说明书提取小鼠肾组织蛋白,采用BCA试剂盒(美国,Thermo Fisher公司)检测样本的蛋白浓度后,水煮变性,置于8%～12%的SDS-PAGE凝胶(武汉,塞维尔生物科技)孔中电泳后,转印至PVDF膜(美国,Merck Millipore公司),50 g/L脱脂牛奶封闭1 h,加入特异性一抗4 ℃孵育过夜。化学发光底物封闭液(enhanced chemiluminescence,ECL)显影液封闭,放置ECL显影系统中扫描聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)并成像。使用Image J软件进行灰度值分析。本研究使用抗体为p-P65抗体(美国,CST公司)。

1.8 实时定量免疫荧光技术(real time qPCR,RT-qPCR)获取小鼠肾组织,采用核酸检测仪检测每组样品RNA浓度,进行PCR反转录合成cDNA,以cDNA为PCR模板,使用ABI荧光定量PCR仪检测系统进行RT-qPCR,检测IL-1、IL-6和TNF-α在小鼠肾组织转录水平表达变化(表1)。

表1 炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和内参GAPDH引物序列

2 结 果

2.1 香叶木素对小鼠血清学指标的影响与Sham组小鼠相比,I/R组小鼠血清BUN(图1A)和Scr(图1B)的浓度显著增加,然而给以香叶木素处理后,BUN和Cr指标下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。

A:尿素氮;B:血肌酐。***与假手术(Sham)组比较,P<0.001;###与模型(I/R)组比较,P<0.001。图1 假手术组、缺血再灌注组和香叶木素组小鼠血清中BUN和Scr含量的比较

2.2 香叶木素对小鼠肾组织结构的影响为评估香叶木素对小鼠肾组织结构的保护作用,我们对不同组小鼠肾组织切片进行HE染色,结果显示I/R组与Sham组小鼠肾组织相比,损伤严重,光镜下肾小管广泛扩张,小管间出现大量红细胞,以及炎性细胞浸润,而给予香叶木素处理后,能显著减少小鼠肾组织损伤程度(图2A);肾损伤评分差异具有统计学意义(图2B)。

A:HE染色(×200),黑色箭头示正常肾小管,红色箭头示损伤肾小管;B:三组小鼠肾小管损伤评分,***与假手术(Sham)组比较,P<0.001;###与模型(I/R)组比较,P<0.001;N.D:没有数据。图2 三组小鼠肾脏HE染色图及肾小管损伤评分

2.3 香叶木素对小鼠肾组织p-P65蛋白表达的影响P65是NF-κB家族关键分子,P65是否磷酸化是NF-κB信号通路激活的关键。我们利用免疫组化技术检测p-P65表达变化情况,结果如图3A所示,I/R组与假手术组比较,p-P65表达量显著增加,且部分小鼠肾小管细胞核表达阳性(图3A黑色箭头所示),香叶木素处理后,p-P65表达量有所降低。免疫印迹实验结果同样发现,I/R组p-P65表达水平与假手术组比较显著增加,而处理组p-P65表达量降低,灰度值分析具有统计学意义(图3B、C)。上述结果说明香叶木素可能通过抑制NF-κB信号通路激活缓解小鼠I/R诱导的急性肾损伤。

A:免疫组化(×400),黑色箭头示p-P65阳性肾小管细胞核;B:Western blot法;C:三组p-P65的表达柱状图,***与假手术(Sham)组比较,P<0.001;###与模型(I/R)组比较,P<0.001。图3 三组小鼠肾组织p-P65蛋白表达

2.4 香叶木素对小鼠肾组织NF-κB下游炎症因子的影响NF-κB下游炎症因子是调控机体炎症的关键因素,我们采用实时定量免疫荧光技术检测NF-κB下游炎症因子IL-1、IL-6以及肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)在假手术组、I/R组和给药组的表达水平变化情况(图4)。I/R损伤组小鼠与假手术组小鼠相比,IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平显著上调,但是在肾I/R损伤中香叶木素能够下调NF-κB相关炎症因子的表达。

***与假手术(Sham)组比较,P<0.001;###与模型(I/R)组比较,P<0.001。图4 实时定量免疫荧光技术检测各组小鼠炎症因子表达水平柱状图

3 讨 论

I/R时,肾小管堵塞并扩张,炎症细胞浸润介导肾小管细胞损伤,致使肾小球滤过率降低、肾单位坏死、肾功能急剧恶化[1,4]。目前由于临床缺少理想的治疗手段缓解肾I/R引起的相关并发症,住院患者死亡率较高,重症患者死亡率可高达50%[5]。因此,寻找新的治疗手段是解决当前困境的关键。

目前,有大量文献报道香叶木素在骨肉瘤、动脉粥样硬化和肥胖等多种疾病中产生保护作用[6-8]。然而目前香叶木素是否能够保护小鼠肾I/R诱导的急性肾损伤以及其潜在的机制还未见报道。本研究实验结果显示香叶木素处理组小鼠血肌酐及尿素氮较I/R模型组小鼠显著降低,通过HE染色结果发现,I/R模型组小鼠肾小管扩张、缺血,肾小管上皮细胞损伤以及大量炎性细胞浸润,提示肾脏I/R导致肾组织损伤,其中以肾小管损伤为主,然而给药组小鼠肾小管扩张、缺血有所缓解,肾小管上皮细胞损伤减轻,且肾小管损伤评分具有统计学意义。NF-κB家族P65是调控炎症表达的关键转录因子,其参与调控炎症级联放大反应,介导炎症细胞聚集并诱导炎症细胞释放炎症因子,在机体中发挥重要作用。为探索香叶木素的保护作用机制,我们检测NF-κB信号通路关键分子P65磷酸化水平。结果发现,与假手术组小鼠相比,I/R组小鼠p-P65蛋白表达量显著增加,然而香叶木素能够降低p-P65蛋白表达水平,表明香叶木素可能通过抑制NF-κB信号通路磷酸化,对I/R诱导的急性肾损伤小鼠产生保护作用。此外,本研究发现香叶木素可减少NF-κB信号通路下游炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平,说明香叶木素能够抑制小鼠体内炎症反应,缓解I/R诱导的急性肾损伤。然而,本研究缺乏相关试验进一步证明香叶木素与NF-κB信号通路的关系。

综合本研究结果,本文证明香叶木素可能通过抑制NF-κB信号通路磷酸化以及该信号通路下游炎症因子的表达,从而缓解小鼠I/R诱导的急性肾损伤,预示香叶木素可能成为一种新的治疗急性肾损伤的药物。