生物炭对设施土壤中聚氯乙烯微塑料植物毒性的影响研究

李 嘉,喻雨霏,崔 敏

(扬州大学环境科学与工程学院,江苏 扬州 225127)

设施农业种植产量大,经济效益高,在我国乡村振兴建设中扮演着重要角色,是缓解我国因人多地少而制约可持续发展问题的有效措施。由于塑料大棚建造容易、成本低且使用方便,塑料棚膜覆盖已成为我国设施农业中占比最大的一种种植模式(>90%)。聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)膜透光率高、保温效果好,被广泛用于建设塑料大棚[1]。以农业大省河南为例,全省约40%的塑料大棚使用PVC膜[2]。然而,PVC棚膜的使用寿命较短,长期的高温和紫外辐射加速了PVC膜的老化破碎,由此产生的PVC微塑料进入设施土壤,加之高强度的水肥管理,导致设施土壤中PVC微塑料污染现象十分普遍[3-4],如武汉市某设施土壤中PVC微塑料丰度高达13 600 个·kg-1[3],对土壤健康和粮食安全构成巨大威胁。

近年来,相关学者围绕微塑料的植物毒性开展了大量研究[5-6]。结果表明,微塑料可通过多种机制对蔬菜作物产生毒害。一方面,微塑料能够附着在根系表面,损伤根系或堵塞养分输运孔道[7-8];小粒径(<2 μm)微塑料能被根系吸收并转移至地上组织[9],干扰植物正常代谢并调控其基因表达[10]。另一方面,微塑料能改变土壤理化性质、影响土壤微生物群落结构和功能并干扰其他土壤污染物的生物有效性[11],从而对作物生长产生间接影响。在众多类型微塑料中,PVC微塑料的植物毒性最强[12-13],这可能与其具有高含量的塑化剂有关[14]。设施土壤PVC微塑料污染造成作物产量、品质降低,给农业生产带来巨大的经济损失。此外,被作物吸收的PVC微塑料可能通过食物链进入人体,严重威胁公众健康。因此,亟需提出缓解农田PVC微塑料植物毒性的措施。

生物炭孔隙发达、比表面积大、表面官能团丰富,具备较强的吸附性能,因此被广泛用于污染土壤修复[15]。研究表明,生物炭能有效钝化土壤中的有机污染物和重金属,并阻控土壤污染物在作物体内积累,从而降低其植物毒性[16-17]。生物炭对于土壤中的颗粒态污染物同样具有较强的固定钝化作用[18],研究表明,向土壤中施加生物炭能降低植物对工程纳米颗粒的吸收[19]。此外,生物炭在土壤改良和作物增产方面也表现出巨大的应用潜力。因此,笔者提出如下假设:生物炭能够缓解土壤PVC微塑料的植物毒性。

为验证上述假设,笔者选取全球消费量巨大的生菜(Lactucasativa)为供试植物,基于盆栽试验,设置空白对照、单一PVC微塑料暴露、PVC微塑料和不同浓度生物炭复合暴露处理组,对比分析不同处理组生菜生长指标和生理生化指标,评估生物炭对土壤PVC微塑料植物毒性的影响,为治理设施土壤微塑料污染提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

碳酸钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢和乙醇购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯。球形PVC微塑料(0.1～1.0 μm)购自东莞中联塑化有限公司。玉米芯生物炭(CCBC)购自河南立泽环保科技有限公司,将CCBC研磨后,过孔径为180～250 μm(60～80目)筛网备用。供试土壤采自扬州大学试验田(32°20′27.20″ N,119°24′01.81″ E),其理化性质:pH为7.16,w(有机碳)为22.6 mg·g-1,w(总氮)为0.78 g·kg-1,w(总磷)为0.89 g·kg-1,w(速效钾)为0.16 g·kg-1,阳离子交换量为5.4 cmol·kg-1,黏粒(<2 μm)质量分数为59.81%,粉粒(2～50 μm)质量分数为32.39%,砂粒(>50 μm)质量分数为7.80%。将土壤置于自然条件下风干,过孔径为850 μm(20目)筛备用。采用目检法测定供试土壤中微塑料丰度较低,为(80±32)个·kg-1,故未对供试土壤作净化处理。生菜种子购自河北省清县兴运蔬菜育种中心。播种前,利用体积分数φ=2%过氧化氢溶液对种子消毒30 min,随后用超纯水反复冲洗。

1.2 试验方法

1.2.1盆栽试验

盆栽试验于2022年6月至7月在光照培养箱(PGX-280-LED,熙扬)中进行。称取200 g供试土壤并将其置于不锈钢盆中,加入2 g PVC微塑料充分混合,配制w=1.0%的PVC微塑料污染土壤;然后,分别加入w为0、0.5%、1.0%、2.5%和5.0%的CCBC,再次混合均匀后将其装入花盆中,于自然条件下平衡14 d。同时,设置无CCBC和PVC的空白组作为对照,每个处理组设置3个平行,共计18盆。盆栽试验设置见表1。选择饱满均匀的生菜种子播种,每盆10粒。培养条件:温度为25 ℃,光照周期为t(光)∶t(暗)=14 h∶10 h,[光]照度为7 000 lx,湿度为65%,每天按照最大饱和持水量的60%浇水。培养7 d后间苗,每盆留1株长势相近的幼苗。培养35 d后收获生菜并测定相应指标。

1.2.2指标测定

将生菜连同根部从土壤中挖出,用超纯水冲洗生菜根部,以去除附着的杂质。用滤纸吸干水分后,用剪刀将生菜从茎枝底端剪开,分为茎叶(地上部)和根部(地下部)两个部分,采用分析天平称量植株鲜重。

取0.2 g新鲜生菜叶片,于研钵中剪碎,加入少许石英砂、碳酸钙粉及2～3 mL体积分数φ=95%乙醇,研磨成匀浆,继续加入φ=95%乙醇研磨至植物组织变为白色,静置3 min后过滤,并用φ=95%乙醇定容至25 mL。使用UV-vis分光光度计(UV-2450, Shimadzu, Japan)测定波长663和645 nm处吸光度。叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和总叶绿素含量计算公式为

(1)

(2)

(3)

式(1)～(3)中ca、cb和ct分别为叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量,mg·L-1;D663和D645分别为663和645 nm波长处提取溶液吸光度;V为提取溶液体积,mL;m为生菜叶片鲜重,g。

取适量新鲜生菜的叶片和根部组织,按照1∶9的质量比将其与磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH为7.4)混合,然后置于冰水浴中匀浆;将生菜组织匀浆液置于低温离心机内,于4 ℃条件下,以10 000 r·min-1的转速离心(离心半径为9.8 cm)10 min后备用。随后,使用南京建成生物工程研究所提供的专用试剂盒测定生菜组织匀浆中的过氧化氢(H2O2)含量、维生素C(VC)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.3 数据分析

所有数据结果均以平均值±标准差表示。采用SPSS 22软件(SPSS Inc., Chicago, USA)对不同处理组数据间差异性进行Fisher LSD检验的单因素方差(ANOVA)分析,显著水平设置为P<0.05。采用Origin Pro 2021软件(OriginLab Corporation, USA)制图。

2 结果与分析

2.1 生菜生长指标的响应

PVC和CCBC对生菜生物量的影响见图1。与对照组相比,PVC单独暴露组生菜叶鲜重和根鲜重分别降低12.04%和23.54%。向含有PVC的土壤中添加w为0.5%～5.0%的CCBC后,生菜叶鲜重和总鲜重呈现先增加后降低趋势,当w(CCBC)为2.5%时达到最大值,显著高于单一PVC处理组(P<0.05)。此外,与单一PVC处理组相比,添加CCBC处理组生菜根鲜重显著增加(P<0.01),但各浓度处理组之间无显著差异。

就叶片或根部或总鲜重而言,柱子上方英文小写字母不同表示不同处理间鲜重差异显著(P<0.05)。

2.2 生菜生理生化指标的响应

2.2.1叶绿素含量变化

如图2所示,PVC单独暴露下生菜叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著高于对照组(P<0.01),分别较对照组增加57.3%、105.7%和70.0%。与PVC单独暴露组相比,添加w为0.5%～5.0%的CCBC导致生菜叶片光合色素含量显著降低(P<0.01);但是,叶绿素含量与CCBC浓度之间不存在相关性。除0.5%CCBC处理组外,其余CCBC处理组生菜叶片光合色素含量均高于对照组。此外,不同处理组生菜叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的变化趋势高度一致。

同一幅图中,柱子上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.2.2H2O2含量变化

如图3所示,单一PVC处理组生菜叶片和根部H2O2含量均显著高于对照组(P<0.01)。与单一PVC处理组相比,所有CCBC处理组叶片H2O2含量均显著降低(P<0.01),且在5%CCBC暴露下达到最小值;除1.0%CCBC处理组外,添加CCBC对生菜根部H2O2含量无显著影响。此外,所有复合暴露处理组生菜根部H2O2含量均显著高于对照组(P<0.01),但叶片中H2O2含量呈现相反趋势。

就叶片或根部而言,柱子上方英文小写字母不同表示不同处理间H2O2含量差异显著(P<0.05)。

2.2.3抗氧化系统变化

如图4所示,单一PVC处理组叶片和根部VC含量显著高于对照组(P<0.01)。除1.0%CCBC处理组外,其余CCBC处理组叶片VC含量较单一PVC处理组显著降低(P<0.01);相反地,CCBC的添加导致根部VC含量增加,且根部VC含量与CCBC浓度呈强正相关(r=0.978 2)。

就同一幅图中叶片或根部而言,柱子上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

与对照组相比,单一PVC处理组叶片CAT活性显著降低(P<0.05),但根部CAT活性显著增加(P<0.01)(图4)。添加0.5%CCBC后,叶片CAT活性显著高于单一PVC和对照处理,其余CCBC处理组叶片CAT活性较单一PVC处理组有所降低。与单一PVC处理组相比,复合暴露处理组生菜根部CAT活性显著降低(P<0.01)。

如图4所示,单一PVC处理组生菜根部GSH-Px活性较对照组显著提高(P<0.05),但生菜叶片GSH-Px活性无明显变化。向PVC污染土壤添加CCBC后,叶片GSH-Px活性较单一PVC处理组显著降低(P<0.05),且在2.5%CCBC浓度条件下活性最低;相反地,随着CCBC浓度从0.5%增加至5%,根部GSH-Px活性逐渐增加;当w(CCBC)≥1%时,根部GSH-Px活性显著高于单一PVC处理组(P<0.01)。

与对照组相比,单一PVC处理组生菜根部SOD活性显著提高(P<0.01),但生菜叶片SOD活性无显著变化(图4)。当w(CCBC)≥1%时,叶片中SOD活性显著低于单一PVC处理组和对照组(P<0.05)。与单一PVC处理组相比,0.5%～2.5%CCBC处理组生菜根部SOD活性显著降低(P<0.05);相反地,5.0%CCBC处理组生菜根部SOD活性显著提高(P<0.05)。

2.2.4MDA含量变化

与对照组相比,单一 PVC处理组生菜根部MDA含量显著增加(P<0.01),但叶片MDA含量无显著变化(图5)。除2.5%CCBC处理组外,复合暴露处理组叶片MDA含量显著低于单一PVC处理组(P<0.05),且叶片MDA含量随CCBC浓度增加呈先增加后降低趋势;同样地,0.5%～2.5%CCBC处理组生菜根部MDA含量降低,但5%CCBC处理组根部MDA含量显著高于单一PVC处理组(P<0.01)。

就叶片或根部而言,柱子上方英文小写字母不同表示不同处理间MDA含量差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 微塑料和生物炭对生菜生物量的影响

笔者研究结果表明,1%PVC微塑料显著抑制生菜的生长(P<0.05),这与文献报道结果[12-13]一致。如图6所示,PVC微塑料能附着在生菜根表面,这可能对根系造成物理性堵塞或机械损伤,影响水分和营养元素的吸收转运[7,20-21],从而抑制生菜生长发育。向PVC微塑料污染土壤添加CCBC后,生菜根鲜重和总鲜重显著增加(P<0.05);随着CCBC浓度的提高,生菜叶鲜重呈先增加后减小趋势,且当w(CCBC)为2.5%时达到最大值。这表明适当浓度CCBC能缓解PVC微塑料对生菜生长的抑制,此与JIA等[22]报道的适量生物炭能缓解多溴联苯醚的植物毒性结果相一致。推测可能的原因包括:(1)生物炭通过吸附固定土壤中的PVC微塑料,减少其生物有效态含量,从而减轻PVC对根系的负面影响;(2)生物炭附着在根表面,抑制了PVC微塑料与根系的接触;(3)生物炭通过改善土壤质量促进生菜生长,提高对PVC微塑料的抵御能力。然而,高浓度(w=5.0%)CCBC对生菜叶鲜重产生的积极影响小于中等浓度,这可能是由于5.0%生物炭对土壤质量产生了负效应。例如,张海晶等[23]研究发现,施加高浓度生物炭会降低土壤饱和导水率,速效磷、溶解性有机碳含量及碱性磷酸酶活性。此外,过量的生物炭附着在植物根系表面也可能抑制植物生长[22,24]。

红色箭头指PVC微塑料。

3.2 微塑料和生物炭对生菜叶绿素含量的影响

叶绿素是植物体内的主要光合色素,其含量高低能够反映光合作用的强弱[25]。笔者研究结果表明,单一PVC暴露增加了生菜叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量,这与PIGNATTELLI等[13]报道的PVC微塑料能提高独行菜(Lepidiumsativum)叶片叶绿素含量结果相一致。研究表明,植物体内叶绿素的合成和降解处于一个动态平衡中[26],PVC暴露后可能会降低叶绿素的氧化和降解,导致叶绿素积累。此外,PVC微塑料能促进氨基乙酰丙酸(合成叶绿素的必要物质)合成,从而提高叶绿素含量[13]。尽管PVC微塑料提高了生菜叶绿素含量,但生菜生物量显著降低,表明PVC微塑料可能通过其他途径对生菜产生毒性。与单一PVC处理相比,0.5%～5.0%CCBC不同程度地抑制了叶绿素的合成。这可能是由于CCBC降低了土壤中PVC微塑料暴露浓度,减弱了PVC对生菜叶绿素的正面影响。

3.3 微塑料和生物炭对生菜H2O2含量的影响

当植物受到环境胁迫时,其体内活性氧(ROS)含量会急剧增加[27]。笔者研究中,暴露于PVC微塑料后,生菜根部和叶片H2O2含量均显著增加,表明PVC微塑料可能对生菜造成氧化胁迫。此外,PVC单一处理组生菜叶片中H2O2含量高于根部,这可能是由于PVC促进了生菜光合作用,进而加速H2O2的合成[24]。CCBC导致生菜叶片H2O2含量出现不同程度降低,表明CCBC能降低PVC微塑料引起的氧化胁迫,这可能与CCBC降低PVC微塑料的暴露浓度有关。相反地,CCBC的添加并未显著改变生菜根部H2O2含量,甚至在特定浓度(1.0%)下提高根部H2O2含量。JIA等[22]指出,生物炭可以增加苋菜(Amaranthusmangostanus)根部ROS含量,笔者研究结果与之类似。这可能是因为PVC和CCBC附着在生菜根系表面并造成根组织损伤,从而促进根部H2O2的产生[27]。

3.4 微塑料和生物炭对生菜抗氧化系统的影响

为了清除ROS并减轻氧化损伤,生物体会激活其体内的非酶抗氧化系统(如VC和谷胱甘肽)和酶抗氧化系统(如SOD、CAT和GSH-Px)[28]。VC是植物体内重要的抗氧化物质,能直接去除自由基[29]。笔者研究结果显示,单一PVC暴露显著提高生菜叶片和根部VC含量。这表明生菜体内VC合成受到刺激,通过促进合成VC来清除PVC微塑料诱导产生的自由基。与H2O2变化趋势一致,CCBC造成叶片VC含量出现不同程度的降低。然而,向PVC微塑料污染土壤中添加CCBC显著增加了根部VC含量,表明PVC和CCBC复合暴露加剧了生菜根部的氧化胁迫,从而需要合成更多的VC以消除积累的自由基。

3.5 微塑料和生物炭对生菜MDA含量的影响

一般来说,抗氧化酶(如SOD和CAT)活性升高表示生物体内存在氧化信号,但并不能说明机体发生了氧化损伤[31]。MDA是膜脂过氧化的最终分解产物,可用于评估膜脂过氧化程度;MDA含量越高,细胞膜受到的损伤就越严重[30]。笔者研究结果表明,单独暴露于PVC后,生菜根部MDA含量显著高于对照组,但叶片MDA含量无显著变化,表明土壤中PVC微塑料主要对生菜根系产生氧化损伤。中低浓度(w=0.5%～2.5%)CCBC显著降低生菜根部MDA含量,表明适量的CCBC对PVC造成的根部膜脂质过氧化损伤存在缓解作用。然而,5.0%CCBC则加剧了根组织的膜脂质过氧化损伤程度。这是由于高浓度CCBC诱导根组织细胞产生和积累大量ROS,导致细胞膜受损,从而增加MDA含量。这表明过量CCBC会加剧植物的氧化损伤程度。向PVC微塑料污染土壤中添加CCBC后,生菜叶片MDA含量总体呈现降低趋势,说明CCBC降低了生菜叶片的氧化损伤程度。

4 结论

PVC微塑料能附着在生菜根表面,诱导生菜根组织产生氧化损伤,影响根系正常生理功能,从而抑制生菜生长。向PVC微塑料污染土壤中添加适量(w=0.5%～2.5%)CCBC能减轻PVC微塑料对生菜根部和叶片造成的氧化损伤,同时促进生菜的生长;然而,高浓度(w=5.0%)CCBC则加剧生菜根组织的氧化损伤程度。因此,通过施加生物炭降低土壤PVC微塑料的植物毒性具有可行性。