不同温湿度条件下微塑料对小麦幼苗生长和生理的影响

李瑞杰,涂 晨,杨 杰,冯裕栋,范桥辉,骆永明①

1.中国科学院西北生态环境资源研究院,甘肃 兰州 730000;2.中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室(南京土壤研究所),江苏 南京 210008;3.中国科学院大学,北京 100049〕

全球对微塑料的关注已由最初的海洋、海岸环境逐渐扩展到了淡水及陆地生态系统[1-2]。植物作为陆地生态系统重要组成部分,其对微塑料的吸收与富集需引起足够重视。已有研究[3]证实,高等植物根系可以直接吸收微塑料并向地上部传输,进而影响植物生长发育。前期研究[4]发现,在水培和砂培条件下,亚微米(0.2 μm)甚至是微米级(2 μm)的聚苯乙烯(PS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球,可通过小麦和生菜新生侧根两侧存在的裂隙进入根部木质部导管,并进一步传输到茎叶组织中。由于微塑料粒径较小,且元素组成与生物质类似,其在植物体内的定量化分析检测仍是技术难题。利用微量金属元素标记的方法可对微塑料的环境归趋进行追踪和量化[5],为实现植物体内塑料微颗粒的准确定量检测提供新思路。虽然目前已有研究揭示了微塑料在植物体内吸收和传输途径及潜在机制,但对植物吸收和传输微塑料的关键控制因素尚不清楚。据报道,LI等[4]采用荧光标记方式探究了蒸腾作用对植物吸收微塑料的影响,发现在不同蒸腾拉力作用下,小麦和生菜对微塑料的吸收有明显差异。并且,植物根内吸收的微塑料可通过植物蒸腾流和根压传输到地上部[3]。因此,探究植物蒸腾环境对植物吸收微塑料的影响至关重要。

进入植物体内的微塑料对植物生长和生理的影响也引起研究者的关注,但迄今仅有少量研究报道了微塑料对植物的影响。研究表明,微塑料对植物的部分生理生化过程具有抑制效应,包括延迟种子萌发[6-7],抑制植物生长[8-9],改变根系性状[10],减少生物量[11],干扰光合作用[12],造成氧化损伤并导致遗传毒性[13-14]。但也有研究发现,微塑料会对植物生长和部分生理指标具有促进作用。例如,LOZANO等[15]发现,纤维、薄膜、泡沫和碎片类微塑料暴露28 d后,胡萝卜生物量均有所增加;LI等[16]发现PS微塑料(300 nm,50 mg·L-1)显著增加了小麦根系活性;LIAN等[17]发现添加w为1%的微塑料显著提高了玉米叶绿素a和类胡萝卜素含量。可见,微塑料对植物生长和生理的影响与微塑料类型、材质、暴露剂量和植物种类等多种因素有关。但有关环境因素在微塑料对植物生长和生理的影响方面研究较少。因此,探究环境因素在微塑料对植物生长与生理状态改变上的影响至关重要。

以全球广泛种植的粮食作物——小麦为供试植物,评估不同温湿度环境对小麦吸收及传输PS微球的量化特征影响,进一步比较不同温湿度环境下小麦对塑料微球吸收的不同造成生长和生理指标变化的差异。研究结果可为评估生长环境对高等植物吸收传输微塑料及相关生物学影响提供方法基础与科学依据。

1 材料与方法

1.1 塑料微球与植物

稀土铕(Eu)标记PS微球(记为Eu-Ps,原液浓度为10 mg·mL-1)购自上海辉质生物科技有限公司,其基本性质表征参照文献[5]。单分散PS微球(原液浓度为10 mg·mL-1)购自天津大鹅科技有限公司。两种微球在水相中均具有良好的分散性和稳定性,颗粒均呈球形,表面带负电荷,平均粒径分别为(0.20±0.01)和(0.21±0.01) μm(附录1)。

供试小麦(Triticumaestivum)种子品种为济麦22,由中国农业科学院提供。挑选大小一致且颗粒饱满的种子,用w为10% NaClO溶液浸泡5～8 min进行表面灭菌,随后用去离子水多次洗涤以去除残留的NaClO溶液。将种子置于经高压灭菌的培养盒内湿润的滤纸上,在25 ℃条件下避光催芽3 d。将小麦幼苗取出洗净并转移至1/5 Hoagland营养液中,在人工气候室中于(25±2) ℃、t(光)∶t(暗)为12 h∶12 h和相对湿度(RH)55%条件下继续培养生长3～5 d。

1.2 不同温湿度条件下小麦幼苗吸收稀土标记微球的量化分析

将0.2 μm Eu标记PS微球原液超声分散3 min后,与1/5 Hoagland营养液混合,配制成5个浓度(0、0.5、5、50和200 mg·L-1)的微球暴露试验液,添加MES缓冲溶液调节暴露液pH约为6.0。向每个盆钵内加入80 mL暴露液,并移入2株小麦幼苗,每个处理设4次重复。采用两个人工气候室分别模拟高蒸腾环境(高温低湿:30 ℃、55%RH)和低蒸腾环境(低温高湿:10 ℃、85%RH),利用热干和冷湿条件的明显差异模拟不同的植物蒸腾作用环境。移栽后的幼苗在两种蒸腾环境条件下的人工培养箱中继续生长7 d,每2 d更换1次培养液。暴露试验结束后,将小麦超声清洗、80 ℃条件下杀青2 h,烘干后用硝酸-硫酸消解,详细前处理方法参照文献[5]。采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,7500,美国安捷伦)测定小麦不同组织内Eu浓度,通过建立PS微球质量与其消解后所测得的Eu质量之间的相关曲线,计算小麦根和地上部组织中微球含量(mg·kg-1)[5]。同时取小麦不同组织经冷冻干燥后,采用扫描电镜(SEM,S-4800,日本日立)观察小麦体内微球的分布特征。

1.3 不同温湿度条件下微球对小麦幼苗的生长与生理影响

将0.2 μm单分散PS微球原液超声分散3 min后,与1/5 Hoagland营养液混合,配制成5个浓度(0、0.5、5、50、200 mg·L-1)的微球暴露试验液。每个盆钵(750 mL)中移入6株小麦幼苗,移栽后的幼苗在两个温湿度环境人工培养箱中继续生长7 d,每2 d更换1次培养液,每个处理设4次重复。

1.3.1小麦幼苗生长指标的测定

培养7 d后,每盆处理采集3株小麦,经自来水和超纯水清洗后用超净纸吸干表面水分。测量每株小麦的主根长度和植株高度,并称量小麦整株鲜重。

1.3.2光合参数和叶绿素含量的测定

培养7 d后,取每组样品,在上午10:00至下午3:00之间,选取从上到下第3片完全成熟的小麦叶片,采用便携式光合仪(LI-6400,美国LI-COR)测定小麦净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度。选取相同位置叶片,冲洗干净后擦干、剪碎并混匀,随后定量称取上述待测样品加入洁净研钵中,再加入适量的碳酸钙粉末及95%乙醇,充分研磨提取光合色素,采用紫外-可见分光光度计(GENESYS 10S,美国赛默飞)测定叶绿素含量。

1.3.3抗氧化酶活性的测定

培养7 d后,每株小麦剪取根部和茎叶各0.1 g,剪碎后置于手动匀浆器中,按m(组织质量)∶V(提取液体积)为1∶9的比例分别加入超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛提取液,冰浴研磨制作组织匀浆。将匀浆低温离心(9 300 r·min-1,离心半径为82 mm,4 ℃,10 min)后取上清液待测。采用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)分别测定小麦根部和地上部超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,测定方法分别参见试剂盒说明书。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0软件进行数据统计和方差分析,采用Duncan法进行各组差异性比较、独立样本的均值检验(t检验)以及Mann-WhitneyU检验。采用Origin 8.6软件对数据和统计结果进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 不同温湿度条件下小麦幼苗吸收稀土标记微球的量化分析

如图1所示,在同一蒸腾环境下,随着微球暴露浓度增加,小麦根系的微球吸收含量显著增加(P<0.05)。

n=3。图柱上方英文大、小写字母不同分别表示高蒸腾和低蒸腾环境中,不同浓度微球处理之间小麦某部分微球积累量存在显著差异(P<0.05)。*表示在同一微球暴露浓度下,小麦某部分微球积累量在高蒸腾和低蒸腾两种环境之间差异显著(P<0.05)。

在高蒸腾和低蒸腾两种生长环境中,小麦根系内微球积累量分别达到15.20～3 902.48和18.50～1 941.97 mg·kg-1。当微球暴露浓度为0.5、5和50 mg·L-1时,高低两种蒸腾环境中小麦根内PS微球积累量差异不显著;而在高浓度微球暴露(200 mg·L-1)条件下,高蒸腾环境中小麦根内微球浓度是低蒸腾环境中的2.01倍。这可能是由于在高蒸腾环境中,小麦根系水力传导率增强,导致对高浓度PS微球的吸收量远远高于低蒸腾环境。这与LI等[4]研究结果一致,利用共聚焦显微镜发现在高蒸腾拉力作用下,小麦和生菜对聚苯乙烯(PS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的吸收量显著增加[4]。在高蒸腾和低蒸腾两种生长环境中,小麦地上部PS微球积累量分别达到1.73～618.14和0.99～387.12 mg·kg-1(图1)。在同一PS微球暴露浓度条件下,高蒸腾环境中小麦地上部微球含量均高于低蒸腾环境,但并未达到显著水平。这说明在一定时间内,同一微球暴露浓度条件下,植物根内微球向地上部的传输量有限。例如,不同植物根内微球向地上部的传输量有限,有研究报道,水培条件下,微塑料在小麦和生菜体内的传输因子分别为0.11和0.10(微塑料暴露浓度为5 mg·L-1)[5],在黄瓜体内的传输因子也达到0.11(微塑料暴露浓度为50 mg·L-1)[18]。此外,微球暴露浓度也影响微球在小麦体内的传输过程,随着暴露浓度增加,小麦地上部微球含量显著增加。与同一量级的土壤暴露浓度相比,水培环境中小麦根内微球积累量(15.20～3 902.48 和18.50～1 941.97 mg·kg-1)远远高于土壤环境中小麦根内微球积累量(3.0～5.2 μg·g-1)[5],表明微球在土壤环境介质中迁移性较差,与植物根系的接触减少。因此,一般室内水培模拟试验中植物对微球的吸收量可能远高于真实环境中微球吸收量。

通过扫描电镜观测小麦根纵截面和茎部横切面(图2a、d、g和j),并对切面上目标区域进行放大(图2c、f、i和l),可观察到根、茎中存在不同形态的PS微球,进一步证明了PS微球在小麦组织中的吸收与传输。在低蒸腾环境中,微球在小麦根内木质部导管中多以单个分散态或者少量聚集态积累;但在高蒸腾环境中,微球多以聚集态形式积累,且多数被小麦根导管内的物质所截留(图2f)。在高低两种蒸腾环境中,PS微球在小麦地上部组织中均以分散态积累分布。结合扫描电镜形貌观测和稀土标记的定量方法证明,微塑料可以被植物根部吸收,并转移到地上部组织中[3-4,18-19],而蒸腾环境是植物吸收和传输微塑料的关键控制因素之一。

根:低蒸腾环境(a～c),高蒸腾环境(d～f);茎:低蒸腾环境(g～i),高蒸腾环境(j～l)。红色箭头指示PS微球。

2.2 不同温湿度条件下微球对小麦幼苗生长与生理的影响

2.2.1不同温湿度条件下微球对小麦幼苗生长的影响

两种蒸腾环境中不同浓度PS微球对小麦根部及地上部生长的影响见图3。

n=3。同一幅图中,图柱上方英文大、小写字母不同分别表示高蒸腾和低蒸腾环境中,不同浓度微球处理之间小麦某指标差异显著(P<0.05)。**和***分别表示在同一微球暴露浓度下,小麦某指标在高蒸腾和低蒸腾两种环境之间在0.01和0.001水平上差异显著。

如图3所示,同一浓度微球处理下,在高蒸腾环境中小麦株高、鲜重均显著高于低蒸腾环境(P<0.05)。在低蒸腾环境中,微塑料暴露浓度对小麦根长、鲜重和株高无显著影响。在高蒸腾环境中,不同浓度微球对小麦鲜重、株高均无显著影响,但不同浓度微球均显著降低小麦主根长度(P<0.05),与对照相比,0.5、5、50和200 mg·L-1微球浓度处理降低率分别为11.72%、12.01%、13.20%和14.43%。随着暴露浓度的增加,PS微球极易发生团聚[20],形成尺寸相对较大的团聚体。与低蒸腾环境相比,在高温低湿的水培介质中微球移动速度加快并容易附着在根系表面,可能堵塞水分和营养物质的运输通道或细胞壁气孔[21-22],从而抑制根系生长。也有研究表明,微塑料可能会通过抑制根尖顶端分生组织活性以及根系细胞活力限制根系生长[10,23]。MENG等[24]研究发现,采用高浓度(w≥1.5%)聚己二酸共对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)处理大豆后,大豆地上部和根生物量显著降低;而低浓度PBAT处理(w分别为0.5%和1.0%)会增加大豆根部生物量,笔者研究结果与之类似。考虑到该研究是基于土培条件,这可能是由于微塑料改变根际微生物群落和增加挥发性有机物所导致的[25]。

2.2.2不同温湿度条件下微球对小麦幼苗光合作用的影响

为了评估不同浓度PS微球对小麦光合作用的影响,对小麦叶片光合色素含量、净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度进行检测,结果见图4。如图4所示,同一蒸腾环境下,光合色素(叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素)对不同浓度微球的响应相一致。在低蒸腾环境中,与对照相比,光合色素含量均呈下降趋势,但未达到显著差异(P>0.05)。而在高蒸腾环境中,与对照相比,当PS微球暴露浓度为0.5、5和50 mg·L-1时,叶绿素b含量分别升高8.43%、3.01%和12.95%;当PS微球暴露浓度达到200 mg·L-1时,叶绿素b含量显著降低31.96%(P<0.05)。聚乳酸(PLA)和PS可以分别显著降低拟南芥和玉米叶绿素含量[2,26],笔者研究结果与之相似。这可能是由于光合色素的生物合成过程需要铁元素参与,而微塑料可显著降低植物体内铁元素含量,进而影响叶绿素含量和光合作用能力[11,27]。其次,微塑料暴露可能使小麦叶片叶绿体和类囊体结构发生改变,这可能最终导致叶绿素含量降低,从而减弱光合能力[28]。此外,微塑料暴露还可能影响光合色素生物合成相关酶的活性[29]。例如,微球可能会导致植物体内活性氧(ROS)积累,而ROS可以通过损害光合作用相关酶活性来下调色素中间体的合成或者过量的羟基自由基促进叶绿素降解[30-31]。

n=3。同一幅图中,图柱上方英文大、小写字母不同分别表示高蒸腾和低蒸腾环境中,不同浓度微球处理之间小麦某指标差异显著(P<0.05)。*、**和***表示在同一微球暴露浓度下,小麦某指标在高蒸腾和低蒸腾两种环境之间分别在0.05、0.01和0.001水平上差异显著。

不同浓度PS微球处理中,高蒸腾环境中小麦叶片蒸腾速率均显著高于低蒸腾环境(P<0.05),表明笔者设计的两种生长环境能满足在小麦体内呈现两种高低蒸腾拉力作用的实验目的。如图4所示,与对照相比,不同浓度微球暴露对两种蒸腾环境中小麦叶片净光合速率、蒸腾速率和气孔导度的影响趋势相一致。在低蒸腾环境中,不同浓度微球处理小麦光合作用参数之间未达到显著差异(P>0.05)。而在高蒸腾环境中,低浓度(0.5 mg·L-1)微球会显著增加小麦叶片光合速率和蒸腾速率(P<0.05)。高低两种蒸腾环境中,不同浓度微球的添加对小麦叶片胞间二氧化碳浓度无显著影响。已有研究发现,聚氨酯〔(3.79±0.60) mm〕可以显著提高玉米光合速率[17],暴露于100和300 nm的聚苯乙烯纳米塑料刺激了玉米叶片蒸腾速率,增加细胞间二氧化碳浓度[32]。然而,也有其他研究报道了相反的现象,例如,微塑料会降低生菜叶片光合速率、气孔导度、蒸腾速率和叶绿素含量等[8]。这可能是由于微塑料降低了参与光合作用的光合色素,损伤了PSⅡ光反应中心,降低了光能转换效率,进而影响植物光合作用[33]。例如,叶绿素b含量在LHCⅡ复合体组装与稳定方面起着重要作用,且LHCⅡ可维持类囊体膜的结构、调节激发能在2个光系统之间的分配,而叶绿素b在高浓度微球暴露条件下会显著降低(图4)。因此,迫切需要深入研究微塑料影响植物光合作用的机制。

2.2.3不同温湿度条件下微球对小麦幼苗抗氧化系统的影响

植物受到逆境胁迫时,会产生超过植物自身清除能力水平的活性氧(ROS),ROS具有较强的氧化能力,会引发植物组织产生一定程度的氧化损伤[3]。丙二醛(MDA)是植物细胞膜中不饱和脂肪酸产生过氧化反应的产物,是表征细胞膜氧化损伤的标志物[9]。一般植物体内MDA含量越高,说明氧化损伤越严重。在植物的抗氧化酶系统中,超氧化物歧化酶(SOD)可将植物体内超氧阴离子自由基转化成过氧化氢与氧气。虽然过氧化氢仍是对生物体有害的活性氧,但植物体内过氧化氢酶(CAT)会将植物体内过氧化氢转化成水和氧气[34]。两种蒸腾环境中不同浓度微球暴露条件下小麦根和茎叶SOD、CAT活性和MDA含量见图5。

n=3。同一幅图中,图柱上方英文大、小写字母不同分别表示高蒸腾和低蒸腾环境中,不同浓度微球处理之间小麦某指标差异显著(P<0.05)。*、**和***表示在同一微球暴露浓度下,小麦某指标在高蒸腾和低蒸腾两种环境之间分别在0.05、0.01和0.001水平上差异显著。

图5显示,同一微球浓度处理下,高蒸腾环境中小麦茎叶SOD活性均显著高于低蒸腾环境(P<0.05)。在高低两种蒸腾环境中,随着PS微球暴露浓度的增加,小麦根和茎叶中SOD活性均逐渐增加。当PS微球暴露浓度达200 mg·L-1时,与对照相比,高蒸腾环境中小麦茎叶中SOD活性显著增加210.12%(图5),这可能是因为活性氧在小麦茎叶中积累,产生应激反应,SOD活性也会显著增加。在低蒸腾环境中,随着PS微球暴露浓度的增加,小麦根和茎叶中CAT活性均未达到显著性差异(P>0.05)。然而,在高蒸腾环境中,随着微球浓度的增加,小麦茎叶中CAT活性显著降低(P<0.05),与对照相比,0.5、5、50和200 mg·L-1微球浓度处理分别降低29.79%、36.65%、38.69%和42.78%(图5)。与低蒸腾环境相比,高蒸腾环境下小麦茎叶氧化损伤较明显,可能是由于高蒸腾拉力促进微球向小麦地上部传输,微球在小麦茎叶中的积累造成组织损伤,也可能是小麦茎叶对SOD活性产生应激抑制作用[35]。中高浓度微球(50、200 mg·L-1)暴露下,高蒸腾环境中小麦根部和地上部MDA含量均显著高于低蒸腾环境(P<0.05)(图5)。在低蒸腾环境中,与对照相比,200 mg·L-1PS微球暴露处理小麦茎叶中MDA含量显著增加26.61%(P<0.05);然而,在高蒸腾环境中,与对照相比,小麦根中MDA含量显著增加12.33%(P<0.05)。抗氧化酶活性和丙二醛含量结果表明,小麦对PS微球胁迫具有一定耐受性,ROS短暂升高是由于小麦为免受PS微球胁迫而产生的自我调节反应,但随着PS微球浓度增加,ROS积累量超过抗氧化酶调节能力的阈值。ROS过量积累会引发小麦根氧化损伤,且PS微球暴露浓度越高,小麦体内ROS积累越多,氧化损伤程度就越明显。GAO等[36]研究表明高浓度微塑料能显著降低CAT活性,可能是由于作为ROS清除剂的CAT被显著消耗,或者是由于酶失活和抑制δ-氨基乙酰丙酸合成(与抗氧化酶合成相关)[37-38],笔者研究结果与之相一致。JIANG等[13]发现,在较低浓度条件下,PS塑料可以诱发细胞的抗氧化防御机制,而在高浓度条件下,产生的过量ROS不能被迅速清除,导致蚕豆中脂质过氧化增加。这一现象的潜在机制有待进一步研究。

3 结论与展望

该文研究了不同温湿度条件下微塑料对小麦生长和生理的影响。在中高浓度微球暴露条件下,高蒸腾环境比低蒸腾环境更利于小麦从水培溶液中快速吸收PS微球并将其传输至地上部。在高蒸腾环境中,不同浓度微球均会显著抑制小麦主根长度,对小麦地上部抗氧化酶系统产生损伤,且高浓度微球会降低小麦叶片叶绿素b含量,但低浓度微球会促进光合速率和蒸腾速率。在高浓度微球暴露条件下,高蒸腾环境中小麦根部和低蒸腾环境中小麦地上部MDA含量均显著升高,出现脂质过氧化损伤。

然而,笔者仅研究了不同温湿度条件下微塑料对植物苗期生长状态的影响,对植物整个生命周期及果实质量等的影响仍有待深入研究,以期揭示环境因素对高等植物吸收微塑料及其毒性作用的影响机制。此外,未来应采用不同类型、形貌和老化状态的环境浓度微塑料进行田间试验,以揭示不同微塑料性状与植物毒性效应之间的作用机制。