日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊十二指肠细菌菌群结构的影响

高 帆,马忠杰,许贵善,2,王 彦,彭婉婉,冯昕炜,2,袁国宏

(1.塔里木大学动物科学与技术学院,新疆阿拉尔 843300;2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室,新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】新疆南疆植被覆盖度低、生态环境脆弱、饲草料质次量少[1-2]。新疆是我国第一大葡萄产区,2019年新疆水果产量为1 604.75×104t,其中葡萄产量为313.17×104t[3]。葡萄皮渣是酿酒葡萄榨汁后或葡萄酒发酵后的剩余物,占葡萄浆果的10%左右,其中葡萄籽占葡萄皮渣的50%左右。我国每年生产的葡萄皮渣在快速增加,但能被用作饲料的皮渣量仅占25%[4]。开发与利用有上升空间[5]。【前人研究进展】葡萄皮渣含有较丰富的粗蛋白质、粗脂肪、碳水化合物和功能性多酚化合物,在反刍动物饲料中可替代一定比例的玉米、豆粕及粗饲料,或作为饲料添加剂应用[5]。郝小燕等[6]研究了葡萄皮渣对绵羊肉品质、肌肉抗氧化性的影响结果显示,葡萄皮渣可降低背最长肌剪切力,对羊肉pH、肉色、蒸煮损失及肌内脂肪含量无显著影响。肠道微生物在刺激新生动物肠道免疫系统的建立[7],以及参与宿主免疫调节方面发挥重要作用[8],另外在动物营养物质降解与利用方面也具有重大意义[9]。细菌作为肠道菌群数量最大的一类,其多样性极高[10]。肠道细菌菌落受遗传[11]、季节[12]、饲料[13,14]和饲养方式[15]等多种因素影响。【本研究切入点】在反刍动物肠道中大量微生物之间相互作用从而实现了对饲料养分的高效利用。正常稳定的肠道菌群是机体健康的重要保证,在促进肠道形态结构发育、维持正常免疫功能及抵御外源致病因子侵袭等方面发挥着重要作用[16]。葡萄籽中含有原花青素单宁,Lee等[17]在研究原花青素对体外肠道菌群的影响中发现,原花青素能够有效抑制肠道致病菌,而对益生菌的影响较小。需研究日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊肠道细菌菌群结构的影响。【拟解决的关键问题】选取25只3月龄体重(20±1.5) kg的健康多浪羊为试验动物,研究在日粮中添加不同比例的葡萄籽对多浪羊肠道细菌结构的影响,为葡萄籽在反刍动物饲料中的开发与利用提供理论依据和基础参数。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2020年7～10月在塔里木大学动物科学与技术学院实验站进行。

参考美国 NRC(2007)体重30 kg、日增重200 g/d的肉羊营养需要,按照“等能等氮”的原则,设计5种添加不同比例葡萄籽的日粮:0%,(对照组,A组)、4%,(B组)、8%(C组)、12%(D组)、16%(E组)。试验所用葡萄籽来自伊犁某葡萄酒厂,自然干燥后用锤片粉碎机粉碎,与其他各饲料原料在混合机内搅拌混匀备用。预混料为每千克全价料提供维生素A 1 300 IU,维生素D 400 IU,维生素E 7.5 mg,铁12.0 mg,铜3.6 mg,锰12 mg,锌12.5 mg,硒0.2 mg,碘1.0 mg,钴0.4 mg。代谢能为计算值,葡萄籽单宁参考卢珍珍[18]文献进行估测,其余营养均为实测值。表1

表1 5种葡萄籽饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

采用完全随机设计。选用3月龄左右、体重(20±1.5) kg的健康多浪羊公羔25只,按照体重相近的原则随机分成5组,每组5只羊。预饲15 d,正饲90 d。试验开始前打扫圈舍,并用84消毒液对羊舍的棚顶、地面、围栏等设施喷洒消毒。试验羊打耳号、剪毛、并用螨净进行药浴,配合使用口服驱虫药阿苯达唑每只羊半片,外加伊维菌素注射液进行驱虫处理。试验羊单栏饲养,日粮按照先精后粗的顺序饲喂。在试验过程中根据每只多浪羊采食和健康情况及时调整饲喂量。每天饲喂2次(10:00和20:00),试验羊自由采食,第2 d饲喂前保证料槽内有大于0%小于5%的剩料。每日清晨清理食槽、水槽,更换洁净的饮水。

1.2.2 样品采集与指标测定

屠宰后取十二指肠中段食糜两管,分别用两个10mL冻存管储存,保存于-80℃冰箱。

解冻后使用TGuide S96 DNA 提取试剂盒完成核酸的提取。使用酶标仪(基因有限公司GeneCompang Limited,synergy HTX)对核酸进行浓度检测,根据检测进行扩增。

检测合格后,根据全长引物序列合成带有 Barcode 的特异引物27F_(16S-F) 5'- AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'和1492R_(16S-R) 5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'(北京百灵克生物科技有限责任公司)对十二指肠内容物基因组 DNA 中的 16S rDNA全长 PCR 扩增。反应混合物的总体积为30 μL,由1.5 μL模板 DNA、3 μL引物混合物(10 μM)、15 μL KOD OneTM PCR Master Mix,10.5 μL ddH2O。扩增程序如下:在 95℃变性2 min,随后在 98℃ 10 s,55℃ 30s,72℃ 1 min 30 ses进行25个循环,并在 72℃延长2 min。扩增后 PCR 产物使用浓度1.8%的琼脂糖进行电泳检测(厂家:北京博美富鑫科技有限公司)对完整性进行检测。最后PacBio Sequel 进行测序。(测序工作在百迈客公司进行)

1.3 数据处理

试验数据经Excel 初步统计后,采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析,使用邓肯法进行多重比较,结果以平均值±标准误(SEM)表示,以P<0.05作为差异显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 Alpha多样性

研究表明,所有样品共测得171 045条CCS序列,每个样品至少产生4 517条CCS序列,平均产生6 842条CCS序列。覆盖指数结果显示,测序深度已接近饱和状态,测序深度可以代表样品中细菌的真实信息。Alpha多样性差异不显著,D组的ACE指数、Shannon指数均高于其它四组,D组菌群丰富度和多样性均高于其他组;而D组的Simpson指数最高,D组菌群多样性是4组中最低的,C组Shannon最小,C组物种多样性是4组中最高。表2

表2 5组多浪羊肠道细菌Alpha多样性指标

2.2 样品OTU统计与分析

研究表明,25个样品测共测出OTU数量为1 038,统计分析试验组与对照组差异均不显著(P>0.05)。图1

五组十二指肠食糜样共有365条相同tags,分别占各组样品OTU的43.76%(A)、45.17%(B)、54.40%(C)、57.57%(D)、55.39%(E)。A组独有44条,B组独有23条,C组独有13条,D组独有17条,E组独有14条。与A组对比,B组有116条tags与A组不同,C组有134条,D组有121条,E组有123条。C组样品菌群种类变化最大。图2

图1 样品OTU个数分布

图2 样品维恩图

2.3 Beta多样性

研究表明,检测到的总微生物的代表性贡献率为30.04%,主成分2(PC2)为纵坐标,贡献率为18.98%。不同颜色点代表不同分组的样本,两样本点越接近,两样本物种组成越相似。随着葡萄籽添加量的升高,各组多浪羊十二指肠肠道菌群相似度逐步提高,D组、E组菌群聚类较好,B组、C组菌群聚类一般,A组菌群聚类较差。图3

图3 PCoA分析

2.4 肠道细菌菌群分类学统计

研究表明,门水平上共测得22种菌门,属水平上发现202种菌属。在门水平上对照组(A)与试验组(B、C、D、E)四组均以厚壁菌门(Firmicutes)为第1优势菌门,D组相对丰度72.27%较其他四组占比最高,组间差异不显著(P>0.05)。在门水平上拟杆菌门(Bacteroidetes)A组显著高于其他4组(P<0.05),随着葡萄籽的添加量的增加抑制了拟杆菌门(Bacteroidetes)的生长。Kiritimatiellaeota A组显著高于B组与D组(P<0.05),并与C组E组差异不显著(P>0.05)。表3

表3 肠道细菌门水平

占比最高的10个菌属,占属水平各组:A组(48.19%)、B组(55.51%)、C组(57.08%)、D组(56.97%)、E组(75.09%),总体水平呈上升趋势,排名前10的优势均属丰度较高。在属水平上Aeriscardovia为A、B、C、E四组第1优势菌群占比最高,而D组第1优势菌群为Lachnospiraceae_NK3A20_group(毛螺菌科NK3A20属)。Christensenellaceae_R-7_group E组显著高于其他B、C两组(P<0.05)。Mogibacterium D组显著高于C、E两组(P<0.05)。uncultured_bacterium_o_WCHB1-41各组间差异显著(P<0.05),其中A组显著高于B、C两组。表4

3 讨 论

3.1 Venn

肠道微生物群落结构主要由宿主遗传、性别、年龄及外界环境因素等决定[18,19]。研究结果表明,在相同品种的试验动物以及相同饲养管理条件下,日粮中添加不同比例的葡萄籽对多浪羊肠道细菌影响差异不显著(P>0.05),但通过维恩图对5组肠道内容物样比较发现,5组共有365条相同tags,与对照组A组相比C组有134条tags不同。在日粮中添加葡萄籽对多浪羊肠道细菌菌群有一定的影响。5组总体微生物组成相似,可能与多浪羊本身抗逆性强有关。

3.2 多样性

Alpha多样性反映微生物物种丰度及均匀度。Chao1指数和Ace指数侧重于微生物丰度。香农指数和辛普森指数衡量物种多样性,受微生物的均匀度和丰度的影响。相同物种丰度的情况下,辛普森指数值越小,香农指数值越大,样品的物种多样性越高[20]。试验数据表明,日粮中添加不同比例葡萄籽对多浪羊细菌多样性影响差异不显著。各组样品覆盖率均达到湖羊瘤胃内微生物群落结构的98%以上,各组样本的测序数据量合理,能较好地反映多浪羊肠道内细菌菌群情况。

3.3 肠道细菌分类学统计

肠道菌群组成的多样性是由环境和宿主遗传因素形成的复杂的多基因性状[21]。动物的肠道内含有数以万计的微生物,包括细菌、真菌、病毒和古生菌等,其中数量最的多的是细菌。这些微生物与宿主共代谢、共进化,形成互惠共生的复杂关系。肠道菌群能够为动物机体提供营养和能量、调节免疫[22]、拮抗病原微生物、参与代谢、甚至影响宿主行为[23]。十二指肠优势菌门主要是厚壁菌门与放线菌门,与前人研究相似[24]。拟杆菌门对纤维以外的其他物质降解起到非常重要的作用,厚壁菌门主要作用是分解纤维物质[25]。相比于对照组,添加葡萄籽显著降低了拟杆菌门的丰度,与Sadet-Bourgeteau等[26]研究结果相似,随着葡萄籽添加量增大抑制了拟杆菌门的丰富度,是由于葡萄籽中含有单宁,随着单宁含量的递增会抑制拟杆菌门的丰度,与赵梦迪等[25]研究相似。厚壁菌门总体差异不显著,数据显示随着葡萄籽添加量的增加总体呈现上升趋势,添加葡萄籽对厚壁菌门丰度有一定促进作用。放线菌门是抗生素、酶与酶制剂的重要产生菌[27],试验数据表明放线菌门相对丰度五组间差异不显著,添加不同比例葡萄籽B组、C组、E组放线菌门相对丰度均大于对照组,添加葡萄籽对放线菌门相对丰度有一定促进作用。A组、B组、C组、E组优势菌属为卡多威亚氏菌属,五组间差异不显著,Aeriscardovia是一种革兰氏阳性菌[28]。短链脂肪酸在肠道发挥重要作用[29],如抗炎、抗腹泻和增强胃肠机能等[30-32],肠道短链脂肪酸含量受制于与毛螺菌属、瘤球菌属、拟杆菌属等[33]。研究中发现,随着葡萄籽添加量的增加毛螺旋菌属丰度显著提高,瘤球菌属、拟杆菌属丰度也呈现上升趋势,其中D组优势均属为毛螺菌科NK3A20属,且显著高于对照组。适宜的添加葡萄籽对抵抗炎症有潜在的促进意义,与杨露等[34]研究相似。

4 结 论

4.1多浪羊十二指肠内容物在门水平上共测得22种菌门,属水平上发现202种菌属,其中优势菌门均为厚壁菌门与放线菌门,优势均属为Aeriscardovia。

4.2随着葡萄籽添加量的增加显著提高了毛螺菌属的丰度,抑制了拟杆菌门丰度,同时对放线菌门、瘤球菌属、拟杆菌属的丰度有促进作用。

4.3日粮中添加不同比例葡萄籽不影响多浪羊肠道细菌多样性,影响部分菌群丰度。