肾透明细胞癌中TIPE2、MMP7 的表达及临床病理意义

齐建军，王晓兰，刘舒悦

山东省昌邑市人民医院肾内科，山东昌邑 261300

肾细胞癌是临床比较常见的肿瘤之一，肾癌中的主要亚型是肾透明细胞癌，有25%～30%的患者在最初诊断时会有转移[1-3]。由于肾透明细胞癌的高发病率和高病死率，因此需要寻求影响肾透明细胞癌患者的具有预后价值的分子标记物，有利于其早期诊断、临床预后的评估。

肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8（ tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like2, TNFAIP8）家族，也叫TIPE 家族，主要作用于维持免疫稳态[4-6]。TIPE2在不同肿瘤中出现表达异常的现象，譬如在胰腺癌、胃癌、乳腺癌中TIPE2 明显低表达[7-9]，而在非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤中明显高表达[10-11]。前期研究发现在肾透明细胞癌中TIPE2mRNA 水平明显增高，提示其可能参与肾透明细胞癌的发生发展[12]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）是一个能降解细胞外基质的酶家族。能够参与降解细胞外基质和基底膜，影响肿瘤细胞的进一步生长[13-14]。

本研究通过免疫组织化学方法检测TIPE、MMP7 蛋白在肾透明细胞癌中的表达情况，并分析TIPE2、MMP7 的表达与常用临床病理参数的关系及TIPE2 与MMP7 的 关系，收集2013年1月—2020年12月在昌邑市人民医院病理科行肾透明细胞癌切除手术患者的60 例标本，研究其在肾透明细胞癌中的临床病理意义，探讨TIPE2 在肾脏透明细胞癌中的临床预后价值。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集于本院行肾透明细胞癌切除手术患者的60 例标本作为实验组，其中男32 例，女28 例；年龄32～78 岁，年龄≥60 岁34 例，＜60 岁26 例；肿物＞7 cm 14 例，≤7 cm 46 例；肿瘤分化程度：中低分化27 例，高分化33例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期49例，Ⅲ、Ⅳ期11例。随机选取30 例癌旁正常肾组织（距离癌旁＞2 cm）标本作为对照组。对纳入研究组患者通过电话、住院等方式随访患者的生存状况。随访时间10～60 个月。本研究经本院医学伦理委员会审核通过，患者签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：患者术前均未接受放化疗；临床病理资料相对完整；肾透明细胞癌组织均伴有正常肾组织。

排除标准：患者接受放化疗；合并其他恶性肿瘤组织；肿瘤周围无正常肾组织。

1.3 方法

免疫组织化学方法 手术切除标本在10%中性甲醛液固定＞12 h，规范取材后经过既定程序处理。免疫组化实验组及对照组均采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase, SP）法。TIPE2、MMP7 兔抗人多克隆抗体作为一抗用于试验组，阴性对照则使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）液替代一抗。一抗（TIPE2、MMP7∶1%BSA 稀释1∶50），4℃过夜。第2 天，恢复至室温，常温加二抗，30 min。滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温，20 min，然后显色，观察、分析并拍照。

1.4 观察指标

免疫组化评分标准：用改良的半定量计分方法，对TIPE2、MMP7 进行评估。TIPE2、MMP7 阳性：于细胞浆内见棕黄色颗粒。染色阳性的肿瘤细胞面积在所有肿瘤细胞中＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，计分0、1、2、3、4 分。根据着色强弱界定-、+、++、+++，计分0、1、2、3 分。根据两评分的乘积分组，＜4 分列入低表达组，≥4 分列入高表达组，见图1。

1.5 统计方法

采用SPSS 21.0 统计学软件处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间差异比较以t检验，计数资料以频数及百分比表示，组间差异比较以χ2检验。用Pearson 相关性分析方法讨论相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIPE2、MMP7 与临床病理参数间的关系

与正常的肾组织中表达（1/30，3.33%）比较，TIPE2 在肾透明细胞癌中高表达所占比例（19/60，31.67%）对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常的肾组织中表达（2/30，6.66%）比较，MMP7 在肾透明细胞癌中高表达所占比例（21/60，35.00%）对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。TIPE2 高表达在肿瘤不同TNM 分期、不同肿瘤分化程度中对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。但在不同肿瘤大小、患者性别、年龄中对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。MMP7 高表达在肿瘤TNM 分期、不同肿瘤分化程度中对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。但在不同肿瘤大小、患者性别、年龄中对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。TIPE2 高表达的肾透明细胞癌患者显示预后不良，见图1。

图1 TIPE2 表达患者生存曲线

2.2 TIPE2 与MMP7 的相关性分析

TIPE2 的表达与MMP7 的表达呈正相关（r=0.251，P=0.028）。见图2。

图2 TIPE2 表达与MMP7 表达相关性

3 讨论

肾细胞癌是发生于肾小管上皮的恶性肿瘤，占肾脏肿瘤的大部分，而肾透明细胞癌是肾细胞癌的主要亚型，在肾细胞癌中占比达80%～90%[3]。随着近几年分子和精准治疗的发展。肾细胞癌的治疗和临床评估也越来越精细。TNM 分期和Fuhrman分级是临床常用的评估指标，但具有相同病理分期的患者，其预后也会截然不同。因此寻找新的用于预防和评估预后的生物学标记物意义重大。

TIPE2（肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8 样2，或TNFAIP8L2）是TIPE 家族的成员，最先发现由白细胞表达[15]。它通过作为局部增强子和信号转导的抑制剂来控制白细胞迁移过程[16]。TIPE2 是炎症和免疫稳态的重要调节因子，TIPE2 可直接作用于肿瘤细胞或通过免疫细胞间接调节肿瘤的发生发展[17]。有文献报道，TIPE2 在胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中出现异常表达[7-11]。

Liu QQ 等[18]在实验中检测了TIPE2 在肺鳞癌、小细胞肺癌和肺腺癌组织中的表达，实验揭示与正常肺组织对比，TIPE2 的表达在肺鳞状细胞癌和小细胞癌中明显降低。在细胞增殖能力方面，转染TIPE2 能够显著阻碍肺癌细胞的生长，进一步影响肿瘤的形成。但Bordoloi D 等[10]在研究中发现，TIPE2 在非小细胞肺癌和小细胞肺癌组织中表达增高，尤其是在非小细胞肺癌中显著增高，参与调节肺癌细胞的多种过程。

表1 肾透明细胞癌中TIPE2 表达与临床病理参数的关系[n(%)]

顺铂作为一种经典的肿瘤化疗策略，已被应用于非小细胞肺癌的临床治疗，但存在化疗耐药的缺点。在Guo H 等[19]的研究中发现，与敏感对照组相比，在顺铂耐药的非小细胞肺癌组织和顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞中TIPE2 表达下调。减少TIPE2的表达有助于细胞对顺铂的抵抗，而TIPE2 的过度表达增强了细胞对顺铂的敏感性，并促进其自噬的过程。异常的TIPE2 表达可能通过以mTOR 依赖的方式干扰非小细胞肺癌中的自噬而导致化疗耐药的发生。TIPE2 可作为克服顺铂耐药非小细胞肺癌的新治疗靶点。以上关于TIPE2 在肺癌组织中的研究结果的不同，可能跟研究者纳入的实验标本、实验条件、操作方法等有关，也提示TIPE2 在不同的癌症或者癌症的不同发展阶段起着不同的作用，TIPE2 调控不同的信号通路可能会影响癌症发生发展的各个方面。

细胞外基质是所有组织和器官的基本核心成分，对多细胞生物的存在至关重要。从有机体发育的最早阶段到死亡，它能够调节和微调身体中的每个细胞过程。在癌症中，细胞外基质在生化、生物力学、结构和地形水平上发生改变，近年来，对基质在实体瘤中重要性的研究和认识呈指数级增长。随着研究基质和细胞-基质相互作用各种元素的新技术的进步，众多研究开始以基质为中心的基质靶向癌症治疗的部署[20]。MMPs 是一组锌结合内肽酶，负责调节细胞外基质微环境的成分。MMP 的激活与各种其他蛋白酶相互作用，共同调节癌细胞的行为，包括生存能力、细胞分化、程序性细胞死亡、血管生成、免疫监测、侵袭性和迁移能力[21]。最小的MMP 成员MMP7 负责广泛底物的代谢，包括纤维连接蛋白、卵黄连蛋白、弹性蛋白、Ⅳ型胶原、聚集蛋白聚糖和蛋白多糖。MMP7 是上皮-间充质转化（EMT）过程的关键蛋白，此外MMP7 通过其促进细胞表面处理细胞因子（如肿瘤坏死因子α）的能力参与炎症反应及癌症的发生[22]。

在癌症治疗过程中，肿瘤转移是治疗的难点，发生转移的基础是癌细胞亚群具有迁移能力。因此，发现与肿瘤转移相关的生物标记物是现在亟待解决的重要问题。陈珠峰等[23]研究中，通过免疫组化方法检测65 例肾细胞癌患者组织及60 例正常肾组织的表达，同时通过ELISA 方法检测65例肾细胞癌患者与对照组健康人群血清中TIPE2的表达，结果表明TIPE2 蛋白在透明细胞肾细胞癌肿瘤组织高表达[18.46%（12/65）中度阳性，81.54%（21/60）强 阳 性]，癌 旁 组 织 中 弱 表 达[35.00%（21/60）不表达，58.33%（35/60）几乎不表达]（P＜0.01）。TIPE2 蛋白水平在透明细胞肾癌患者组血清中（均值：4.69 ng/mL；25%～75%区间：2.22～14.03 ng/mL）也高于正常对照组（均值：2.27 ng/mL；25%～75%区间：1.17～5.28 ng/mL）（P＜0.05）。TIPE2在透明细胞肾细胞癌肿瘤及血清中明显高表达。张冠军等[24]通过免疫组织化学SP 法检测78 例肾细胞癌组织及相对应的癌旁肾脏组织中MMP-7的表达情况，证实MMP7 蛋白水平在肾癌组织中也显著增高（肾细胞癌组织中阳性表达率55.1%，而癌旁正常肾组织基本无表达）（P＜0.05），并与肾细胞癌的浸润、转移对比，差异有统计学意义（P＜0.05），与临床分期有关（r=0.392，P＜0.05），说明TIPE2 、MMP7 表达异常与肾癌的发生有关。在本研究中，通过免疫组化方法检测TIPE2 、MMP7 在60 例肾癌组织和30 例正常肾组织的表达情况，结果表明TIPE2 在正常的肾组织中表达（1/30，3.33%）和肾透明细胞癌中高表达（19/60，31.67%）对比，差异有统计学意义（P＜0.05），与正常的肾组织中表达（2/30，6.67%）比较，MMP7 在肾透明细胞癌中高表达（21/60，35.00%）对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。TIPE2 高表达在不同肿瘤TNM 分期、肿瘤分化程度中对比，差异有统计学意义（P＜0.05），但与肿瘤大小、患者性别、年龄对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。MMP7 高表达在不同肿瘤TNM 分期、肿瘤分化程度中对比，差异有统计学意义（P＜0.05），但与肿瘤大小、患者性别、年龄对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。并且TIPE2 高表达的肾透明细胞癌患者显示预后不良（P＜0.05）。这与前期研究结果相符。并且本研究发现TIPE2 在肾透明细胞癌中的表达与MMP7 的表达呈正相关（r=0.251，P=0.028），MMP7 作为EMT调控的关键蛋白，提示TIPE2 在肾透明细胞癌中的作用与EMT 过程相关，但是它是如何影响EMT的，将会是进一步研究的重点。

以上实验结果提示，TIPE2 在肾透明细胞癌组织中明显高表达，并与肾透明细胞癌的分化低、高TNM 分期高侵袭性因素有一定关联，高TIPE2 表达的肾透明细胞癌患者明显预后不良。前述报道，TIPE2 作用于非小细胞肺癌顺铂的耐药过程，研究TIPE2 在癌症的发生发展过程其临床意义重大、有远大的前景。本研究的实验数据也为以后更好的研究TIPE2 和肾透明细胞癌的预防、早期诊断、预 测转移、治疗提供一定的理论基础。