一株嗜热脂肪芽孢杆菌的筛选及其产酶特性研究

张运祺，郑自强，邢浩博，应超，兰茂华，任志强，2，卫春会，2*

（1.四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；2.中国轻工业酿酒生物技术及智能制造重点实验室，四川宜宾 644000）

白酒酿造离不开曲，曲的品质影响白酒的酒质和酒体风格，按制曲温度可分为低温曲、中温曲、中高温曲和高温曲[1]。因高温制曲工艺更能增加曲香，白酒企业青睐于使用中高、高温曲酿造名优酒，在高温酿造环境中，细菌尤其是嗜热芽孢杆菌经环境筛选成为优势菌群[2-3]。嗜热芽孢杆菌能够代谢香味物质，分泌纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等多种功能酶，是中高温和高温曲内的重要微生物，其作用主要突出表现在将淀粉和蛋白质降解为氨基酸和可发酵性糖，嗜热芽孢杆菌的发酵特性与制曲的“三高”工艺匹配，优良嗜热芽孢杆菌的筛选与应用成为行业内提高酒曲品质的重要研究方向[4-5]。

近年来，随着经济迅速发展，提高优质酒率需求逐渐增加，酿造优质酒所用的高温曲品质备受关注，大曲功能芽孢杆菌微生物相关报道屡见不鲜。张立强[6]从大曲中分离筛选得到2 株纤溶酶活力较高的贝莱斯芽孢杆菌（Bacilus velezensis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其能够合成活性肽、地衣素和吡嗪类化合物等多种生理活性物质；刘晓昆[7]研究了高温大曲中10 株产淀粉酶、蛋白酶的细菌菌株,确定其中8 株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2 株为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，为揭示大曲功能微生物及其作用、增强白酒风味、提高白酒产量提供了数据参考；冯利芳[8]从清香大曲中筛选出1 株高产中性蛋白酶的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，经制曲应用，强化大曲的糖化力提高了13.7 %，液化力提高了125 %，中性蛋白酶活提高了101.5 %，酸性蛋白酶活提高了7.65 倍。虽然大曲中芽孢杆菌微生物的资源利用受到学者关注，但在高温极端制曲环境中可发挥良好产酶功能的嗜热菌研究尚有不足。

本研究以高温大曲为菌源，筛选具有产淀粉酶和蛋白酶功能的嗜热芽孢杆菌，经生理生化鉴定和分子鉴定确定其种属关系，对其生长特性和产酶特性进行研究，并用于强化大曲探究其功能特征，以期为高温曲的优化应用提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

高温大曲取自川北某浓香型酒厂（顶温约为62 ℃），取样后粉碎均匀混合分装于密封袋，4 ℃保存；麸皮、高粱为市售。

1.1.2 试剂

3，5-二硝基水杨酸（化学纯）、磷酸二氢钾、可溶性淀粉（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；三氯乙酸、溴百里香酚蓝、羧甲基纤维素钠（分析纯），成都市科龙化工试剂厂。

1.1.3 仪器设备

SW-CJ-IF 超净工作台，苏州净化有限公司；TC1000-G PCR 扩增仪，上海欢奥科技有限公司；MicroSreen HT 实时微生物生长曲线分析仪，杰灵仪器制造天津有限公司；A360 紫外可见光光度计，上海翱艺仪器有限公司；ChemiDocXRS+化学发光成像系统，日本SONY 公司。

1.1.4 培养基

LB 培养基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。（固体培养基添加琼脂粉15 g/L。）

淀粉固体培养基：可溶性淀粉10 g/L，牛肉膏0.9 g/L，蛋白胨3 g/L，氯化钠1.5 g/L，琼脂15 g/L，pH7.0。

酪素固体培养基：干酪素10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，溴百里香酚蓝0.05 g/L，琼脂15 g/L，pH7.0。

羧甲基纤维素钠固体培养基：羧甲基纤维素10 g/L，蛋白胨2 g/L，七水合硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，琼脂15 g/L，pH7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 嗜热芽孢杆菌的富集

无菌条件取大曲样品5.0 g 于145 mL 无菌生理盐水中，置于120 r/min 摇床30 min，随后置于80 ℃水浴锅中水浴处理1 h，取菌悬液5 mL 接入灭菌冷却后的LB 液体培养基，接种量为5 %（v/v），培养温度为60 ℃，于120 r/min 摇床内培养24 h，为富集液[8]。

1.2.2 嗜热芽孢杆菌的筛选

（1）初筛。取富集液在超净工作台内用LB 固体培养基适宜梯度下稀释涂布，60 ℃倒置培养24 h，分别挑取形态不同的单菌落于LB 固体培养基相同条件下划线倒置培养24 h。

（2）复筛。挑取划线后生长出的单菌落接入灭菌后的LB 液体培养基中，60 ℃培养24 h，转接一次，为种子液，取种子液装入25%甘油管，-80 ℃储藏备用；挑取单菌落点植于淀粉培养基、酪素培养基和羧甲基纤维素钠培养基上，50 ℃培养48 h 后观察透明圈的大小，测量并计算透明圈直径(D)和菌落直径(d)的比值(D/d)，筛选产酶能力较强的菌株。

淀粉酶培养基透明圈的观察采用碘液染色法[9]；蛋白酶培养基透明圈直接观察；纤维素酶培养基透明圈的观察采用刚果红染色法[10]。

1.2.3 嗜热芽孢杆菌的形态学鉴定

取种子液于LB 固体培养基适宜梯度下稀释涂布培养24 h，培养温度为60 ℃，观察菌落形态特征情况，并拍照记录。

1.2.4 嗜热芽孢杆菌的分子生物学鉴定

取种子液提取细菌DNA，使用Takara 试剂盒提取细菌DNA，操作步骤为试剂盒步骤。

PCR 引物[11]：正向引物为27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')，反向引物为1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR 体系：27F 引物1 µL、1492R 引物1 µL、MIX 酶12.5µL、DNA 模板1µL、ddH2O 9.5µL。

PCR条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，72 ℃补充延伸10 min，循环30 次。

将扩增产物进行电泳，于凝胶色谱成像仪下观察扩增结果。将扩增结果好的引物送至上海生物公司测序，测序结果在NCBI 中的Gen Bank 数据库进行同源性比对分析，利用MEGA7.0 软件建树确定菌种。

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 嗜热芽孢杆菌的生长特性分析

（1）生长曲线测定。配制LB 液体培养基，灭菌后按接种量为1%（v/v）接入种子液，180 r/min 摇床内40 ℃温度下培养24 h，空白组为未接种的培养基。每隔1 h 取适量菌液，测定发酵液的OD600nm值，绘制生长曲线。

（2）生长特性测定。配制LB 液体培养基，分别设置在不同初始pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、不同NaCl 浓度(0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %，浓度单位为m/v)、不同乙醇体积分数（0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %）以及不同温度（35 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）下培养种子液，测定发酵液的OD600nm值，探究嗜热芽孢杆菌不同条件下的生长情况。

1.2.5.2 嗜热芽孢杆菌的产酶特性分析

将菌株单菌落以2 %(v/v)的接种量接入LB培养基，55 ℃、180 r/min 振荡培养。取发酵液5000 r/min 离心10 min，上清液作为粗酶液[12]。蛋白酶酶活力的测定方法采用福林酚法[13]；淀粉酶酶活力的测定方法采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[14]。

蛋白酶活力单位：在55 ℃、pH7.0 的条件下，水解酪素1 min 产生1 μ g 酪氨酸作为一个酶活力单位，用U 来表示。

淀粉酶活力单位：在55 ℃、pH7.0 的条件下，以每分钟水解底物可溶性淀粉生成1 μ mol 还原糖（以葡萄糖计）所需酶的量作为一个酶活力单位（U）。

1.2.5.3 嗜热芽孢杆菌强化麸曲应用

参考传统麸曲制作工艺，制作浅盘麸曲，以砖状金属盒为模具，取100 g 麸皮和10 g 麦粉混匀，4 层纱布封口，121 ℃灭菌20 min，烘干备用；取10 mL种子液高速离心集菌，用无菌水将菌体接种至麸皮麦粉中作为实验组，以直接添加等量无菌水的为空白组，拌匀封口，37 ℃恒温培养3 天后烘干备用[15-17]。

1.2.5.4 数据处理

结果均采用x±Sd 的形式表示，SPSS 19.0 数据进行显著性分析，Excel 和origin 软件进行图表制作；采用DNAstar 进行DNA 序列修剪，通过NCBI数据网站进行同源性比较，使用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 嗜热芽孢杆菌初筛和复筛结果分析

选择初筛后的菌种经划线纯化，得到单菌落，结合革兰氏染色镜检观察菌落形态特征，并将分离出的纯种菌株点植到淀粉培养基、酪素培养基和羧甲基纤维素钠培养基上。结果表明，得到1 株具有良好产淀粉酶和蛋白酶能力的嗜热芽孢杆菌，命名为ZJY-1，其菌落特征、镜检及透明圈复筛结果见图1。由图1 可知，菌株ZJY-1 的菌落紧贴培养基生长，呈扁平状，白色，菌落不透明，暗沉，表面干燥，菌落边缘不整齐；通过镜检观察，菌体呈杆状，革兰氏染色呈紫色；3种培养基复筛后，菌株ZJY-1 淀粉酶透明圈直径为1.50 cm，菌落直径为0.30 cm，直径比为5.00，蛋白酶透明圈直径为1.70 cm，菌落直径为0.60 cm，直径比为2.83，纤维素酶筛选培养基上无透明圈产生。

图1 ZJY-1 菌落特征、镜检及透明圈复筛结果

综合上述结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[18]，初步确定菌株ZJY-1 为具备一定产淀粉酶和蛋白酶能力的嗜热革兰氏阳性芽孢杆菌。

2.2 嗜热芽孢杆菌的分子生物学鉴定结果分析

为进一步确定菌株ZJY-1 的种属关系，提取菌株ZJY-1 的DNA，通过PCR 扩增后进行凝胶电泳观察条带，将合格的PCR 产物进行测序，基于16S rDNA 基因序列菌株ZJY-1 的系统发育树见图2。由图2 可知，菌株ZJY-1 与土芽孢杆菌属Geobacillus高度相关，且与嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus strain）S2M(KJ722527)聚为同一支，其同源性为100.00 %，建树结果表明菌株ZJY-1 为嗜热脂肪芽孢杆菌。

综合菌落特征、镜检及分子生物学结果，确定菌株ZJY-1 为土芽孢杆菌属的嗜热脂肪芽孢杆菌。

2.3 菌株ZJY-1 的生长曲线测定

掌握细菌生长规律有助于研究其生理和生产实践。本试验对菌株ZJY-1 的生长曲线测定结果如图3 所示，可看出菌株ZJY-1 在0～5 h 时，菌体生长缓慢，处于停滞期，在6～16 h 时，菌株生长迅速，为对数期，在16～20 h 时生长更为缓慢，为平稳期，21 h 后菌株ZJY-1 进入衰亡期。

2.4 嗜热芽孢杆菌的生长特性分析

图2 基于16S rDNA 基因序列菌株ZJY-1 的系统发育树

图3 菌株ZJY-1 的生长曲线测定分析

菌株应用方向主要为白酒制曲环境，环境差异会直接影响微生物的新陈代谢活动[19]。为将菌株ZJY-1 用于生产应用，本文在不同的pH 值、温度、NaCl 浓度及乙醇浓度下进一步考察了菌株ZJY-1的生长特性，结果如图4 所示。

pH 影响了细菌分泌酶的表达，适宜的pH 值条件可保证芽孢杆菌生命活动正常进行（图4a），菌株ZJY-1 随着培养初始pH 值的增加生长更加旺盛，并在初始pH7.0 时生长最好，当初始pH 值继续增加至偏碱性时，生长状况下降。秦立芹[20]从酱香型白酒酿造环境中筛选得到1 株产淀粉酶的细菌，发现其在pH5～9 范围内生长良好。结果表明，中性环境更适宜菌株ZJY-1 的生长。

图4 菌株ZJY-1 的生长特性测定分析

图5 菌株ZJY-1 的产酶特性测定分析

芽孢杆菌可生成芽孢，嗜热菌对高温环境有着更强的适应能力，但过高的温度会影响功能酶的表达，降低细胞代谢能力（图4b），随着培养温度的增加，菌株ZJY-1 菌体浓度增加，对高温表现出良好的应激性，在培养温度为55 ℃时生长最为旺盛，OD600值此时最高，达到了0.85，随着培养温度继续升高，细菌生命活动受到抑制，但在65 ℃时依旧可存活，当培养温度到达70 ℃时，菌株ZJY-1 基本停止生命活动，结果表明，菌株ZJY-1 有良好的嗜热性，在50～65 ℃范围内皆可生长旺盛。

盐浓度与乙醇浓度常作为微生物生长特性的考察因素，其改变了培养环境的渗透压和细胞膜的吸收，高盐浓度会导致细菌失水死亡，高乙醇浓度会给细菌带来毒害作用从而失活[21]。由图4 可知（图4c、图4d），菌株ZJY-1 的最高耐受NaCl 浓度为4%，超过4%时菌株趋近死亡，最高乙醇耐受浓度为4 %，在6 %浓度及更高浓度下细菌停止代谢。结果表明，菌株ZJY-1 对于环境盐浓度和乙醇浓度耐受表征接近大多数细菌，但并未表征出优良的NaCl 盐和乙醇耐受性。

2.5 嗜热芽孢杆菌的产酶特性分析

通过前期试验，菌株ZJY-1 可能同时具备产蛋白酶和淀粉酶能力，大曲中的细菌微生物主要表达淀粉酶和蛋白酶，为进一步了解其产酶特性，在适宜条件下，每隔12 h 测定淀粉酶活和蛋白酶活，在不同发酵时间段酶活力测定结果如图5 所示，随着发酵时间的延长，菌株ZJY-1 蛋白酶和淀粉酶的活力呈先增加后下降趋势，菌株的蛋白酶酶活在36 h时达到最高，达到了181.8 U/g±8.3 U/g，淀粉酶酶活在24 h 达到最高，最高达137.6 U/g±5.1 U/g，随后随发酵时间延长酶活显著降低，当发酵时间到48 h时达到较低值，淀粉酶活仅有32.5 U/g±3.1 U/g，蛋白酶约为27.3 U/g±7.1 U/g。

2.6 嗜热芽孢杆菌强化麸曲应用

为初步探究菌株ZJY-1 应用于曲的产酶能力，以菌株ZJY-1 为菌源制备种子液，接入麸皮培养基制备嗜热芽孢杆菌麸曲，测定其麸曲生物量和功能酶活力，考察ZJY-1 强化麸曲酶活力和生物量指标，结果如表1 所示，以菌株ZJY-1 为菌源制备的强化麸曲仍可保持较高的酶活力，淀粉酶活为133.5 U/g±12.5 U/g，蛋白酶活达到了175.4 U/g±4.8 U/g；对其生物量进行检测，结果发现，ZJY-1 强化麸曲的生物量指标较高，达到了5.7×1010±2.8×109CFU/g，高于市售麸曲生物量指标，菌株ZJY-1表现出了优异的产淀粉酶和蛋白酶能力，发挥其酶活性功能的前提下，生物量指标突出，可用于强化麸曲扩培。

3 结论

本课题以优化高温大曲发展为背景，从高温大曲中筛选芽孢杆菌，并初步探究了菌株应用于强化曲的价值，结果如下：

表1 ZJY-1 强化麸曲酶活及生物量测定分析

从高温大曲中筛选出了1 株嗜热菌株ZJY-1，鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus strain），菌株具备产淀粉酶和蛋白酶能力，分析其生长特性发现菌株盐耐受和乙醇耐受能力为芽孢杆菌普遍耐受范围，适宜生长在中性pH值环境，在65 ℃高温环境下仍长势良好；在不同发酵时间下进行酶活力检测，其淀粉酶活力最高为133.5 U/g±12.5 U/g，蛋白酶活力最高为175.4 U/g±4.8 U/g；以菌株ZJY-1 为菌源制备强化麸曲，ZJY-1麸曲具有良好产蛋白酶和淀粉酶能力，且生物量指标较高，可达到5.7×1010±2.8×109CFU/g。

本研究突破了高温大曲菌种应用中的不耐高温、功能酶活性不足、菌种生物量低等难点，丰富了高温大曲功能菌资源，为高温曲优化提供了一定的理论基础和科学指导。