窖泥中放线菌的分离鉴定及生理特性研究

黄书琴，郑若欣，江科，丁俊，朱海，任志强，3*

（1.四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；2.四川国检检测有限责任公司，四川泸州 646000；3.中国轻工业酿酒生物技术及智能制造重点实验室，四川宜宾 644000）

浓香型白酒的酿造以窖泥为基础，窖泥中的微生物起关键作用，不同年龄和不同地理区域的微生物群落有着十分明显的差异，某些微生物种群是白酒特有挥发性化合物的活跃群体[1-2]。放线菌作为酿酒工业生产中的四大微生物之一，在白酒酿造中扮演着极为重要的角色[3]。目前,在传统白酒行业生产领域,有关放线菌的研究主要集中在白酒发酵过程中大曲、曲房、酒醅、以及窖池中放线菌的分离鉴定[4，19]，也有少量文献[4-6，18]对与白酒酿造有关的放线菌代谢物质和发酵特性进行了研究报道。由于放线菌不是酿造中的优势菌群，且作用机理尚不清楚，因此与细菌、酵母菌、霉菌在传统白酒酿造中相比，对放线菌的研究报道相对较少。目前，少量研究显示放线菌不仅积极参与土壤中有机物质的转化，还会产生许多活性酶类如淀粉酶，纤维素酶等，以促进高分子化合物降解，被降解的物质在酵母菌和细菌的作用下产生乙醇、乙酸、乙酸乙酯等，同时还会水解蛋白质生成氨基酸，为己酸菌的生长提供前体物质[7]。因此，本研究从浓香型白酒窖泥中分离放线菌株，对目的菌株进行多相分类鉴定及部分生理代谢特性研究。该研究不仅能增加窖泥中有关放线菌研究领域的内容，还能探究放线菌在窖池中的性能以及在白酒酿造中如何发挥作用，为更好地研究混菌发酵提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

1.1.1 样品

取自川西某酒厂的浓香型窖泥，取窖底的窖泥，采用5 点取样法，取出后分装并抽真空密封，冰袋送回，4 ℃保存，及时处理。

1.1.2 试剂

可溶性淀粉、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、重铬酸钾，成都市新都区木兰镇工业开发区；硝酸钾、七水硫酸镁、氯化钠、琼脂粉，成都市科龙化工试剂厂；胰蛋白胨、酵母提取物，北京双旋微生物培养基制造厂；鲁戈氏碘液，50 mg/L K2Cr2O7溶液，75 mg/L K2Cr22O7溶液，1 mg/mL 青霉素溶液，2 mg/mL 青霉素溶液，3 mg/mL 青霉素溶液，18 mg/mL 的制霉菌素溶液，50 倍TAE 缓冲溶液，质量分数1 %的琼脂糖溶液。

1.1.3 培养基

高氏一号固体培养基[8]：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、Na‐Cl 0.5 g、FeSO4·7H4O 0.01 g、蒸馏水1000 mL、琼脂粉20.0 g、pH 7.4～7.6，121 ℃、0.1 MPa 下灭菌20 min。LB 培养基[9]：酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂粉20.0 g（固体添加）、蒸馏水1000 mL、pH 7.2～7.4，121 ℃、0.1 MPa 下灭菌20 min。水琼脂培养基：琼脂粉20.0 g，蒸馏水1000 mL，自然pH 值，121℃、0.1 MPa 下灭菌15 min。淀粉水解培养基[10]：淀粉2.0 g、牛肉膏2.0 g、蛋白胨17.5 g、琼脂粉17.0 g、蒸馏水1000 mL、pH7.0，121 ℃、0.1 MPa下灭菌20 min。

1.1.4 仪器设备

超净工作台JJ-CJ-2FD，苏州净化设备厂；电热恒温干燥箱labserv-LS-0610，上海一恒科仪器有限公司；电镜扫描仪DM3000，德国徕卡仪器有限公司；恒温震荡培养箱ZWYR-D2403，上海智城分析仪器有限公司；生化培养箱LS-1201，上海三发科学仪器有限公司；凝胶成像仪Chemi‐DocXPS+，美 国BIO-RAD公司；PCR 仪C1000 Touch，美国BIO-RAD 公司；电泳仪164-5070，美国BIO-RAD 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 放线菌株的分离纯化

本试验采用稀释涂布平板法并用以下几种预处理方式[11]对窖泥样品进行放线菌的分离。

（a）干热处理：准确称取10 g 窖泥样品于锥形瓶中后封口，120 ℃干热处理1 h，取出加入90 mL无菌水，28 ℃、180 r/min 振荡摇匀3 h 备用。

（b）湿热处理：水浴锅内65 ℃处理30 min，其余操作同（a）。

（c）无特殊处理：其余操作同（a）。

抑制剂浓度：制霉素溶液记为（A）；50 mg/mL重铬酸钾记为（B1）；75 mg/mL 重铬酸钾记为（B2）；青霉素溶液记为（C1）1 mg/mL、（C2）2 mg/mL、（C3）3 mg/mL，抑制剂均在无菌条件下添加到培养基中。

1.2.2 放线菌株的鉴定及生理特性

1.2.2.1 单菌落形态学特征观察

将分离得到的放线菌菌株点种在高氏一号固体培养基平板上，28 ℃倒置培养3～5 d，观察菌落形态；进一步无菌操作制片，采用显微镜观察放线菌的个体形态。

1.2.2.2 放线菌株的生理生化试验

（1）生长曲线的测定。挑取放线菌单菌落接种于10 mL 高氏一号液态培养基，28 ℃、120 r/min 震荡培养72 h，该培养液作为测定生长曲线的种子液。以1 %的接种量将种子液接种于装有150 mL高氏一号液态培养基的500 mL 三角瓶中，置于28 ℃、120 r/min 震荡培养，每隔6 h 取样检测菌体生长状况，每株放线菌接种27 瓶，每个时间点取样3 瓶。菌体生长状况采用菌体干重法进行表示，具体操作为：将滤纸烘干称重初始质量m1，将每瓶混合均匀后取100 mL 菌液过滤，烘干后称重结束质量m2，100 mL 菌液中所包含的菌体质量为m2-m1。

（2）最适温度测定。将放线菌种子液以体积分数2%的接种量接入已灭菌的50 mL 高氏一号液体培养基中，设置培养温度20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，每组温度设置3 个平行，于120 r/min，恒温培养3 d。以干重法表示菌体生长状况。

（3）最适pH 测定。用10 mol/L NaOH 调节高氏一号液体培养基pH 值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，每组pH 值设置3 个平行，按照（2）的方法接种后于35 ℃，120 r/min，培养3 d。以干重法表示菌体生长状况。

（4）乙醇耐受力测定。用无菌的乙醇调节高氏一号液体培养基酒精度至2 %vol、4 %vol、6 %vol、8%vol、10%vol，每组酒精浓度设置3 个平行，按照（2）的方法接种后于35 ℃，120 r/min，培养3 d。以干重法表示菌体生长状况。

1.2.2.3 分子生物学鉴定

本研究按照Takara 全基因组[12]提取试剂盒方法对分离纯化后的细菌进行DNA 提取。以上游引物[13]27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和下游引物[13]1492r：5'-ACGGTTACCTTGTTAC‐GACTT-3'进行PCR 扩增。扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环，最后72 ℃补充延伸10 min，16 ℃保温5 min。取2 μ L PCR 产物用1 %琼脂糖凝胶检测PCR 扩增效果；将PCR 得到的基因产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果在NCBI 进行Blast 比对分析；将所得序列在Contigexpress 软件上拼接及校正，获得Fasta 格式文件，按照Neighbor-joining 法在Mega7.0 软件上构建系统发育树。

1.2.3 产抗生素测定

本试验采用双层琼脂扩散法测定抗生素。采用LB 固体培养基，将灭菌后的牛津杯垂直放入水琼脂表面，在冷却至50 ℃的LB 固体培养基中接种体积分数为7 %的指示菌液，混匀后倒入底层水琼脂，待其凝固后取出牛津杯。在形成的空洞内加入200 μ L 菌液，静置30 min 后在37 ℃的恒温条件下培养12 h。本试验分别做革兰氏阴性菌检测和革兰氏阳性菌检测，在形成的3 个孔洞内加入菌液，1个孔洞内加入相同量50 mg/L 重铬酸钾溶液作为标准对照。

1.2.4 产淀粉酶测定

用点种法将分离纯化后的放线菌接种于高氏一号固体培养基，置于37 ℃的恒温条件下培养，平板中明显出现生长良好的菌落时滴加鲁戈氏碘液观察透明圈。

2 结果与分析

2.1 窖泥中放线菌的分离

从土壤中分离放线菌前，对土壤的预处理尤为关键。不同的处理方式和抑制剂的添加会筛选出不同功能的放线菌株，同时在一定程度上也会抑制其他非目的菌株的生长，还会激发稀有放线菌孢子的生长，提高出菌率[14]。本研究采用1.2.1 所示3种预处理方法处理窖泥样品。分离结果如表1 所示，由表1 可知，65 ℃湿热处理加制霉素18 mg/mL、青霉素3 mg/mL 的组合（bAC3）及不做特殊处理加K2Cr2O750 mg/mL、青霉素1 mg/mL 的抑制剂组合（cB1C1）均分离出放线菌，其余组合均未能分离出放线菌。对分离出的放线菌分别编号为X、Z。结果表明，窖泥中放线菌的分离较为困难，尤其是干热处理条件下，放线菌菌体和孢子受到高温和水分的影响失去活性，在培养基上几乎无法生长。干热处理作为一种对土壤普遍使用的预处理方式[11]，湿热处理窖泥样品从中筛选放线菌株可能是一种更为理想的方式。

表1 分离培养结果

2.2 窖泥中放线菌株的形态学鉴定

本试验从窖泥中分离、纯化出2 株具有放线菌菌落形态特征的菌株，分别命名为菌株X 和菌株Z。菌株X 形态学鉴定结果见图1，菌株X 在高氏一号培养基中于28 ℃倒置培养3 d 后菌落呈不规则圆状，白色或淡黄色，菌落质地干燥，表面起粉，有明显土腥味（图1-A）；在40 倍显微状态下菌落呈绒毛发射状（图1-B）；在1000 倍显微镜下菌株X由长菌丝和分支菌丝组成，存在孢子链且呈直链状（图1-C）。菌株Z 形态学鉴定结果见图2，菌株Z在高氏一号培养基中于28 ℃倒置培养3 d 后菌落呈圆状，白色，菌落质地干燥，有明显土腥味（图2-A）；在40 倍显微状态下菌落呈发射状（图2-B）；在1000 倍显微镜下菌株Z 由长菌丝和分支菌丝组成（图2-C）。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》符合链霉菌属的基本形态，因此，初步将该两株放线菌归为链霉菌属。

图1 菌株X 的菌落及菌丝形态

图2 菌株Z 的菌落及菌丝形态

2.3 窖泥中放线菌的分子生物学鉴定

为进一步确定菌株X 和菌株Z 的分类学地位，将两株菌的DNA 提取后进行PCR 扩增，结果显示（图3），2 株放线菌的PCR 产物条带单一，符合测序条件。将扩增后的样品进行送样测序，测序结果在NCBI 的GenBank 数据库中进行同源序列搜索，分别获得7 个与菌X 和8 个与菌Z 同源性较高的模式菌株的16S rDNA 序列。通过MEGA7.0 软件进行多序列比对，按照Neighbor-joining 法在Mega7.0 软件上构建系统发育树，从聚类分析树状图可以看出（图4），在属分类水平上，2 株菌属于链霉菌属（Streptomyces），在种水平上，X 菌与Streptomyces griseoplanus菌株YJ-RT8 聚成一群，并稳定单独成枝，序列同源性为99.72 %；Z 菌株与Streptomyces drozdowiczii菌株1136 聚类在一个系统发育分支上，序列同源性为99.72%。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》的鉴定方案，并结合菌落形态特征、显微镜形态特征分析，确定X 菌株属于产灰链霉菌（Streptomyces griseus），Z 菌株属于德氏链霉菌（Streptomyces drozdowiczii）。

图3 16S rDNA PCR 扩增结果

图4 菌株系统发育树

2.4 窖泥中放线菌的生理特性

2.4.1 放线菌的生长曲线

本研究采用干重法绘制2 株菌的生长曲线，结果见图5。由于菌株进入新环境后的生长发育需要一定的时间适应和调节，放线菌X 和放线菌Z 在0～12 h 时均处于生长延滞期，在12～48 h 时间段内菌株干重呈几何级数增长，此时对数生长期出现，在培养48 h 后菌株生长量达到最大，此阶段菌株的形态、生理活性等都比较典型，对外界环境因素敏感，探究遗传性能多选用此时期的菌体。

图5 两株放线菌的生长曲线

2.4.2 放线菌的最适生长温度

本实验两株放线菌最适生长温度结果见图6。菌株X 的干重随着温度的升高呈先增加再降低的趋势，在25 ℃有最大干重，表明其最适生长温度在25～30 ℃之间，在20～25 ℃之间干重差比较大，表明在这个温度范围内X 菌株的代谢十分活跃，菌株的生长发育对该段温度的变化非常敏感。在25 ℃时Z 菌株也有最大干重，最适生长温度也在25～30 ℃之间，可能的原因是在窖池中发酵过程中心最高温度在35 ℃左右，放线菌群的生长发育在该温度范围下得到适应。

图6 两株放线菌的最适生长温度

2.4.3 放线菌的最适生长pH 值

两株放线菌的最适生长pH 值结果见图7，菌株X 在pH6.5 时有最大干重，在pH5.0 时有最小干重，整体呈先上升再下降的趋势，表明放线菌株X 有较差的耐酸性且对酸度变化十分敏感，适宜在弱酸环境下生长，可能是浓香型白酒发酵过程中窖泥长期浸泡于黄水中，黄水呈弱酸性，使窖泥中上层也呈弱酸性，窖泥中的微生物经过长期生长发育代谢驯化为适宜弱酸环境，因此能在此环境下良好生长。菌株Z 表现为对酸性环境的变化不敏感，但同样在pH6.5 时有相对较大干重，表明在此酸性条件下菌株Z 生长最为活跃。

图7 两株放线菌的最适生长pH值

2.4.4 乙醇耐受力测定

两株放线菌乙醇耐受力结果见图8，随着酒精浓度增大，两株菌的长势均减弱；菌株X 以及菌株Z 分别在酒精度为10%vol 以及酒精度为8%vol 时失去活性。在白酒发酵过程中窖池中的酒精积累是一个由少到多的过程，说明存在着对放线菌株生长促进作用由大到小的酒精浓度梯度，放线菌在窖池中得到了长期的驯化，使得窖泥中的放线菌可以慢慢适应酒精因素。

图8 两株放线菌的乙醇耐受力

2.4.4 放线菌株产抗生素特性

本试验采用双层琼脂扩散法分别对得到的两株放线菌进行革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌抑菌性实验，通过观察抑菌圈的有无及大小反应两株菌产抗生素的情况，结果见图9。两株菌在阴性菌平板上和阳性菌平板上均无明显抑菌圈，说明两株菌的产抗生素能力很弱或者不产抗生素。放线菌因为生殖上的劣势，不得不通过产生抗生素来对抗快速繁殖的微生物，以获取对自身有利的营养物质和生存空间，窖泥中的微生物经过长期的驯化，群落之间形成了稳定的生态环境，在这一稳定生态系统中被选择出的放线菌无需产生抗生素也能良好的生长。

图9 两株放线菌产抗生素抑菌性实验

2.4.5 放线菌株产淀粉酶特性

有研究表明[15-16]，放线菌具有较高的酶活力，且能够利用淀粉酶分解淀粉产生葡萄糖，与此同时，窖泥中的产己酸菌可以利用放线菌产生的葡萄糖产生己酸，从而提高己酸产量。基于此本研究分别对两株菌进行了产淀粉酶能力测定实验，通过观察分解圈的有无和大小研究两株菌产淀粉酶能力强弱。结果如图10 所示，两株菌所在平板均能观察到分解圈，且菌株X 所在平板的分解圈明显大于菌株Z，表明菌株X 和菌株Z 均能够产生淀粉酶，且菌株X 的产淀粉酶能力更强。结果表明窖泥中放线菌能够分解淀粉，为其他菌株的生长提供营养物质。

图10 两株放线菌的淀粉分解试验

3 讨论

本研究通过对窖泥预处理并选择合适抑制剂的方法，自浓香型白酒窖泥样品中筛选分离获得放线菌X 和放线菌Z，并对两株放线菌进行多项分类鉴定，以及生理代谢特性研究。结果表明，两株放线菌在实验室条件下培养可正常生长，并产生大量孢子。通过PCR 测序以及系统发育树的建立，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》，确定X 菌株属于产灰链霉菌（Streptomyces griseus），Z 菌株属于德氏链霉菌（Streptomyces drozdowiczii）。通过对两株放线菌的生长进行跟踪发现，两株放线菌生长发育基本同步，生长曲线均在12～48 h 时间段内呈几何级数增长，进入对数期生长阶段，并在48 h 后进入稳定期和衰亡期。两株菌的繁殖随着温度的升高均呈现出先增高后降低的趋势，且最适生长温度区间在25～30 ℃，两株放线菌最适生长酸度为pH6.5，菌株X 在酒精度10 %vol 时不耐受，菌株Z 在酒精度8 %vol 时不耐受。菌株X 和菌株Z 均能够产生淀粉酶，表明放线菌可以分解淀粉为其他有利菌的生长提供葡萄糖，从而影响白酒风味。菌株X 和菌株Z 均未产生抗生素，表明在这一稳定生态系统中被选择出的放线菌无需产生抗生素也能良好的生长。