应用酶制剂进行木薯发酵乙醇的工艺优化研究

尚红岩，程燕琳，2，刘俊敏，2，江雪晶，邓毛程*，陈秀丽，吴曼亚，曾艳

(1.广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东广州 510300；2.广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510303；3.广东省科学院南繁种业研究所，广东广州 510316)

木薯作为一种非粮经济作物，种植面积广，是全球发酵酒精使用最广原料之一,以木薯生产燃料乙醇将迎来巨大的发展机遇[1]。美国到2022 年，可再生能源的比例将达到新高峰，例如生物乙醇1.363×1011升。2015 年，欧盟推行的生物乙醇计划占到了5 %的市场份额，2020 年进一步增加到10 %[2]。我国2020 年要在全国范围内推广使用车用乙醇汽油，基本实现全覆盖，因此燃料乙醇的生产状况对车用乙醇汽油的推广具有十分重要的意义[3]。

木薯淀粉含量高，木薯原料发酵生产乙醇是一个复杂的系统工程，包括蒸煮糊化、液化、糖化和发酵等阶段，需要淀粉酶和糖化酶的酶解，这是目前常用双酶法工艺。木薯中除了含有淀粉还含果胶质等大分子物质，果胶是一种多糖，加水后以不稳定的胶体状态存在于醪液中，使醪液粘性增加，还会附着在活性材料的表面，阻止酶类与淀粉原料接触，降低原料糖化发酵的效率。发酵前加入果胶酶，将果胶水解为小分子糖，有利于提高酶解和发酵率[4]。酶制剂应用能够优化乙醇的生产工艺，提高产品质量和生产效率。乙醇的工艺优化也将带动酶制剂的开发与应用[5]。本研究以木薯粉为原料，通过单因素实验和正交实验对液化工艺进行优化；通过添加果胶酶，研究对木薯糖化和发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

木薯粉，市售；耐高温α-淀粉酶20000 U/g，糖化酶150000 U/g，果胶酶100000 U/g，广州瑟烨生物科技有限公司；酿酒活性干酵母，广西丹宝利酵母有限公司。

试剂及耗材：碘液、浓硫酸、酚酞、氢氧化钠、尿素等均为分析纯，广州化学试剂厂。

仪器设备：UV-520 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；PHS-3 精密酸度计，上海大普仪器有限公司；FA224 电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DK-98-II 电热恒温水浴锅，郑州长城可供贸有限公司；98-1-C 数显控温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；YX-280 型手提压力蒸汽灭菌锅，广州越特科学仪器有限公司；101-3AB 型电热鼓风干燥箱、DHP-9162 电热恒温培养箱，上海恒科科学仪器有限公司；酒精浓度计，河北省武强县同辉仪表厂。

1.2 试验方法

1.2.1 木薯发酵酒精工艺流程（图1）

图1 木薯发酵酒精工艺

1.2.2 木薯液化工艺单因素条件研究

(1)调浆：称取木薯粉加水调浆，为考察料液比对发酵酒精的影响，分别选择1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 的料液比，加入耐高温ɑ-淀粉酶50 U/g，设置液化温度105 ℃，液化时间60 min，研究不同料液比对木薯粉液化效果和发酵的影响。

(2)液化：将木薯粉按1∶2.5 的料液比例加水调浆，pH 调至6.0～6.5，加入耐高温ɑ-淀粉酶50 U/g，搅拌摇匀，研究不同液化温度（95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃）和液化时间（45 min、60 min、75 min、90 min）对木薯液化效果和发酵酒精浓度的影响，液化结束后加入碘液，如无显色反应即液化完成，记录碘液检验的颜色。

(3)糖化：液化结束，液化液冷却至60 ℃后补水至原体积，加入10 %硫酸将pH 调至4.2～4.5，加入200 U/g 糖化酶，放置到58～62 ℃水浴锅中糖化60 min。糖化结束后降温至32 ℃。

(4)发酵：称取0.8%活性干酵母（糖化液重量），加到10 倍的32 ℃无菌水中，搅拌溶解，复水活化10 min，加入糖化液中，31～33 ℃恒温发酵72 h。

(5)发酵结束后，测定发酵液残还原糖含量；对发酵液进行蒸馏，测定蒸馏酒液的酒精浓度。

1.2.3 木薯液化工艺正交实验优化

为了进一步优化木薯淀粉液化工艺条件，在单因素实验的基础上，设计正交实验。选择液化料液比、液化温度和液化时间三个因素作正交试验，试验因素和水平见表1。以发酵成熟醪液残还原糖和酒精含量做评价指标。

表1 正交实验因素水平表

1.2.4 果胶酶对木薯淀粉糖化和发酵的影响

果胶是以半乳糖醛酸为主的复合多糖类物质，加水拌料后以胶体形式存在于醪液中，使醪液粘度增大，在果胶酶作用下果胶会水解生成低分子量的半乳糖醛酸，降低醪液黏度。按步骤1.2.2 优化后液化工艺液化木薯淀粉，液化结束后冷却至60 ℃后补水至原体积，加入10 %硫酸将pH 调至4.2～4.5，加入200 U/g 糖化酶，分别添加果胶酶50 U/g、75 U/g、100 U/g、125 U/g，混匀后在58～62 ℃水浴锅中糖化60 min，然后降温至32 ℃，接种0.8 %活性干酵母，恒温发酵时间为72 h。发酵结束后测定发酵液残还原糖，对发酵液进行蒸馏，测定蒸馏酒液的酒精浓度。

1.2.5 检测方法

木薯粉液化液结果检验[6]：碘液检验，淀粉的存在与否可以用碘液检查，淀粉具有在碘液中变蓝的特性。

酒精度的测定：蒸馏-酒度计法，量筒量取100 mL发酵液，放入蒸馏烧瓶内，用100 mL 蒸馏水冲洗量筒，放入蒸馏烧瓶内，蒸馏并收集馏出液100 mL，用酒度计测定馏出液酒精浓度。

外观糖度的测定：糖锤度计法。

总糖、还原糖的测定：采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS 法)[7]。

1.2.6 数据处理与分析

每组实验重复3 次，实验结果取平均值，用Ex‐cel 软件对实验数据进行统计和绘图，SPSS 19.0 进行正交实验数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同料液比对液化条件的影响

木薯粉生产酒精需要加水调浆，料液比（加水量）是非常重要的参数，加水量过多，会使最终发酵酒精含量低，增加酒精蒸馏能耗；加水量过少，会使醪液黏度大，影响醪液的混合、输送、加热和冷却等，进一步影响液化和发酵效果。木薯粉以不同料液比配料后液化和发酵的实验结果见表2。

表2 不同料液比对液化条件的影响

由表2 可知，随着料液比的变化，发酵醪液酒精浓度呈现上升的趋势，残还原糖含量相应降低，当料液比1∶2.5 时，酒精浓度最高达到12.13 %vol，残还原糖的含量最低；料液比1∶3.0 时，酒精浓度降低，残还原糖含量增高；当料液比1∶3.5 达到酒精浓度最低值。综合分析表明，料液比在1∶2.5 时，酒精发酵效果最佳。

2.2 不同液化温度对发酵酒精的影响

温度是液化过程中最重要的因素之一，不仅影响反应速度，也影响ɑ-淀粉酶的活性。提高温度可以提高反应速度，加速酶的反应效率，提高温度和降低反应速度会导致酶蛋白逐渐变性，导致酶的反应效率降低甚至失活。本实验使用的耐高温ɑ-淀粉酶，宜在95 ℃以上液化，为此考察了95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃4 个温度对液化的影响，所得结果如表3 所示。耐高温α-淀粉酶在液化温度较低时液化淀粉的能力相对于高温时液化能力弱，酒精发酵酒精浓度随着温度的升高而升高，液化温度105 ℃左右液化效果较好，发酵酒精浓度可达12.29 %vol，液化温度110 ℃和105 ℃时发酵酒精浓度相近，出于节能考虑，选择相对最优液化温度为105 ℃。

表3 不同液化温度对发酵酒精的影响

2.3 不同液化时间对发酵酒精的影响

为了研究液化时间对发酵酒精的影响，液化时间分别设定为45 min、60 min、75 min、90 min，液化后进行碘检试验，用碘检试验后的颜色和酒精浓度评价液化的完成情况，结果见表4。

表4 不同液化时间对发酵酒精的影响

表5 液化实验正交实验L9(33)结果

由表4 可以看出，液化时间在60 min 时，酒精浓度最高，发酵效率最好；液化时间在45 min 时，碘检结果不达标，液化不完全；当液化时间由60 min延长至75 min 后，酒精浓度下降。原料液化时间不充分会形成生料，导致整个发酵过程中染菌；如果液化时间过长同样会影响发酵效果，影响出酒率。实验结果表明，液化时间以60 min 为最佳，所以，确定最佳的液化时间为60 min。

2.4 木薯粉发酵酒精液化正交实验影响

木薯液化三因素三水平正交试验L9(3)3结果见表5。由实验结果可知，按照极差R 大小确定的因子影响主次顺序为：料液比＞液化温度＞液化时间，以酒精浓度为主要评价指标，最好的工艺参数配合水平为A2B2C1，即料液比1∶2.5，液化温度为105 ℃，液化时间为60 min。用最优因素组合A2B2C1进行验证试验，发酵液酒精度达到12.58 %vol，残还原糖为0.33 %。高于正交表中最高酒精浓度12.49 %vol，液化和发酵效果相对最好。

2.5 果胶酶对木薯发酵酒精的影响

2.5.1 果胶酶的添加方法

果胶是以半乳糖醛酸为主的复合多糖类物质，果胶酶通过水解作用切断果胶分子的α-1,4糖苷键，将果胶降解释放还原性末端，使果胶黏度降低[8]，可有效降低发酵醪液黏度，增加可发酵糖的含量。

2.5.2 果胶酶不同添加量对木薯发酵酒精的影响

添加不同浓度果胶酶对酒精发酵的酒精浓度影响，如图2 所示。

图2 果胶酶对酒精发酵的酒精浓度影响

从图2 可知，在一定范围内发酵酒精中的酒精浓度随着果胶酶用量的增加而增大，用量从0到75 U/g，酒精浓度有明显变化，说明在此范围内，增加果胶酶用量，提高酒精浓度效果显著，继续增加果胶酶用量时，酒精浓度呈现下降趋势，说明继续增加果胶酶用量对提高发酵酒精的优化工艺意义不大。从经济以及效果优化考虑，75 U/g 果胶酶的添加量为较合适果胶酶用量。

添加果胶酶对酒精发酵相关指标的影响，如表6 所示。

表6 果胶酶对酒精发酵的相关指标影响

从表6 可知，随着果胶酶用量从0 到75 U/g，酒精发酵后残还原糖含量有明显变化，残还原糖降低，有利于酒精发酵；继续增加果胶酶用量，残糖含量增高，说明继续增加果胶酶用量优化工艺意义不大，综上相关指标研究，选取75 U/g 果胶酶添加量进行后期实验。

3 结论

在木薯发酵酒精中，添加α-淀粉酶、糖化酶、果胶酶和优化液化工艺能显著提高发酵液酒精含量。本文研究了木薯淀粉料液比、液化温度和液化时间对淀粉液化效果和酒精发酵的影响。通过单因素试验和正交实验优化，以酒精浓度和残糖作为评价指标，确定木薯粉液化的最佳料液比1∶2.5，液化温度105 ℃，液化时间60 min，相应发酵酒精浓度为12.58 %vol，残还原糖0.33 g/100 mL。在糖化过程中，考察了糖化酶和果胶酶对糖化发酵的影响，通过单因素实验添加不同用量果胶酶考察了对木薯酒精发酵影响，以1∶2.5 的料液比进行配料，优化后的液化条件进行液化，加入10 %硫酸将料液pH调至4.2～4.5，设置温度58～62 ℃，加入200 U/g糖化酶、75 U/g 果胶酶，水浴锅中糖化60 min，接种0.8 %干酵母发酵，发酵成熟醪液还原糖含量最低为0.37 g/100 mL，酒精度最高达到14.40 %vol，远高于不加果胶酶的发酵酒精浓度，木薯发酵酒精添加适量的果胶酶，对糖化和发酵影响显著，可明显提高发酵酒精浓度。