青梅果酒饮后舒适度酒体关键成分研究

姚逸萍，阳欣，石俊，阚光明，韩兴林，顾志媛，宋涛，李登勇，皇甫洁*

(1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；2.重庆江记酒庄有限公司,重庆 402289；3.国家酒类品质与安全国际联合研究中心,北京 100015)

随着社会的发展，酒从日常餐桌上助兴、消愁解闷的必备品，逐步演变成为一种文化的代名词，酒体的品质也得到越来越多的关注。社会经济的发展进步，物质文化水平的提高，人们对酒的消费正逐步走向理性化，对酒的品质提出了更高的要求，酒类消费市场已经由饮酒转向舒适饮酒，饮后舒适度是酒类产品品质非常重要的体现[1-2]。酒的饮用舒适度是人体对所饮用酒的最直接感受，换言之，饮后舒适度最直接地反映了酒品质好坏[2]。

酒类产品特有的风味主要源自酒体中的微量物质[3]，这些微量成分构成了种类繁多、风格各异的酒体风格[4-5]，还对人体内酒精代谢及饮后舒适度起重要影响作用。酒精进入人体后首先经过血液进入肝脏，通过肝脏功能代谢分解，主要对肝脏造成严重压力。短期饮酒会造成呕吐、记忆力减退、情绪不稳定等神经问题[6]。长期摄入大量酒精会导致行动力丧失，意志模糊，甚至引起昏迷[6-7]。

配制酒又称为调制酒，是指以发酵酒、蒸馏酒或食用酒精作为酒基，配加一定比例的可食用辅料（花、果、动植物、中药材等）或食品添加剂（如着色剂、甜味剂、香精等）进行调配、混合或再加工制成的，改变了原酒基风格的饮料酒[8]。配制酒中含有丰富的氨基酸、有机酸类物质、糖类物质、酮类物质以及香气成分。

果酒是一种以果汁或者新鲜水果为原料,经独特的发酵方式和工艺技术制备的低酒精度饮料酒[9]。根据张倩茹等[10]的研究，果酒的主要成分为糖类物质、酸类物质、氨基酸、酚类物质、香气成分。发酵完成后，果酒中酸的含量和种类相对稳定，主要含有酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸等有机酸。柠檬酸和抗坏血酸具有生物活性。酚类化合物是果酒中主要活性成分，影响果酒的色泽、香气还有口感，主要包括花青素、黄酮醇、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、酚酸等[10]。香气物质是果酒中重要的功能性组成成分，也是评价果酒品质的重要指标，香气成分主要包括醇类、醛类、酯类、酮类、酸类和萜烯类等物质。香气成分不同，果酒的特征香气也不相同，比如异戊醇具有焦糊味，苯乙醇具有玫瑰香味，糠醛具有谷物香气，苯甲醇具有花香味等[10]。

甲醇是酒类酿造过程不可避免的的产物之一，对人体有很大危害，摄入甲醇5 g 就会导致严重中毒，摄入12.5 g 便可能导致死亡。甲醇的毒性主要在于对中枢神经系统具有麻醉作用，并且在体内蓄积不易排出。甲醇还会在人体中被转化为甲酸和甲醛，毒性更大，会对视力造成不可逆转的伤害[11]。

青梅果酒顾名思义，是用青梅酿制而成，以青酸为口味的果酒，具有杀菌、消除疲劳、改善肠胃功能、改善血液循环、镇痛、强化肝脏功能、抗氧化等功效。本研究通过对饮酒后大鼠酒精代谢程度的对比研究，同时根据酒体主要成分包括多酚、二氧化硫、甲醇、氨基甲酸乙酯、氰化物、有机酸、醛类、酮类和吡嗪类物质的含量数值，建立多元线性回归模型，预测影响青梅果酒饮后舒适度的酒体关键成分。对青梅果酒在饮后行为及酒精代谢中起关键作用的酒体风味成分初步确定，以期为青梅果酒产品品质提高提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 实验酒样

选择5 款市售青梅果酒，如表1 所示。

表1 实验酒样列表

表2 梯度洗脱程序

向1#—5#酒样中分别加入不同程度的标准食用酒精(96%vol)，将所有酒样的酒精度统一调整到20%vol。

1.1.2 试剂及耗材

琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、硝酸钠、苹果酸、乙醛、丙醛、异丁醛、糠醛、乙缩醛、苯甲醛、丙酮、3-羟基-2-丁酮、三甲基吡嗪以及酚类物质等标准品，均为色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 仪器设备

PE Aoutosystem XL 气相色谱仪及PE TurboM‐atrix 40 自动顶空进样器，美国PerkinElmer；Clarns 600 气相色谱仪，配火焰离子检测器（flame ioniza‐tion detector,FID）,美国PerkinElmer；ICS-3000 型离子色谱仪,配有EG4 淋洗液自动发生器、电导检测器和Chromeleon 6.80 色谱工作站，美国Dionex 公司；高效液相色谱仪(high performance liquid chro‐matography,HPLC)Agilent 1260，安捷伦科技有限公司；Milli-Q 超纯水仪，美国Millipore 公司；BS 124S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物选择和灌胃剂量

将25 只SPF 级SD 大鼠(鼠龄42 d，平均体重200 g)于清洁二级环境适应性饲养一周后，随机分组，每组5 只动物。以人体每日摄入纯酒精剂量0.90 g/kg 单位体重为标准，根据大鼠与人体药理学等效剂量进行合理折算，确定每只大鼠灌胃剂量为6 mL。实验动物的相关处理均严格遵守实验动物福利伦理与保护相关规定，随时接受实验动物伦理委员会的监督与检查，许可证号为(JK)2021-W-003。

1.2.2 主要酒体成分定量测定

有机酸采用ICS-3000 离子色谱测定。将样品稀释50 倍后，过孔径为0.45 μ m 过滤膜后待用。柱温设置为30 ℃。Ionpac AS11-HC分离柱（250 mm×4 mm），Ionpac AS11-HC 保护柱（50 mm×4 mm），淋洗液流速为1.0 mL/min，电导检测器进行检测，进样量25 μ L。EG 淋洗液发生器自动产生KOH 淋洗液梯度淋洗：0～16 min，KOH 浓度为1.1 mmol/L；17～29 min，KOH 浓度为16.5 mmol/L；29～35 min，KOH 浓度为20.0 mmol/L；35～39 min，KOH 浓度为35.0 mmol/L，稳定2 min；41～47 min，KOH 浓度为50.0 mmol/L，随后下降；在47.1 min 时KOH 浓度下降至1.1 mmol/L，稳定至59 min 结束。抑制器再生模式：外加水抑制器。定性方法：将标准品用超纯水溶解并稀释，建立标准工作曲线。以峰面积进行定量。

风味物质采用Clarus 600 气相色谱仪测定。吸取10 mL 酒样后置于25 mL 容量瓶当中，加入0.1 mL 1 %内标液，均匀混合后进行检测。CPWAX57CB 毛细管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μ m），载气(高纯氮)流速1 mL/min，分流比：10∶1；氢气：流速为45 mL/min；空气：流速为450 mL/min；检测器温度：270 ℃；进样器温度：240 ℃；进样量：1 μ L。柱温程序：起始温度35 ℃，恒温6 min，以4 ℃/min程序升温至60 ℃，以6 ℃/min 程序升温110 ℃，恒温3 min，以6 ℃/min 程序升温至205 ℃，恒温13 min。定性方法：将标准品用无水乙醇溶解并稀释，建立标准工作曲线。采用内标法进行定量。

酚类物质采用安捷伦Agilent 1260 高效液相色谱测定。检测器：VWD-1260 检测器；色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；检测波长：280 nm；流动相，A 相：5 %甲醇+0.1 %甲酸+水，B 相：5 %乙腈+0.1 %甲酸+甲醇；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μ L。梯度洗脱程序如表2 所示。

甲醇、氰化物、氨基甲酸乙酯和亚硫酸盐的测定依照国标检测方法，检测方法依据如表3 所示。

表3 检测方法依据

1.2.3 灌酒后大鼠血清乙醇乙醛含量测定

灌胃酒样后2 h 采用断尾取血，采集血液标本0.3 mL，加入30 μ L 肝素钠(1800 U/mg)，混匀后于离心机中3500 r/min 离心10 min，取上清液，即为血浆，于-80 ℃贮存，待测其乙醇和乙醛含量。

依据《血液酒精含量的检验方法GA/T 842—2009》进行改进，用以检测乙醇和乙醛含量。对待测血浆进行20 倍稀释，取稀释样品1 mL 置于顶空瓶中，密封待用。采用PE Aoutosystem XL 型顶空气相色谱仪，PE TurboMatrix 40 自动顶空进样器进行检测。色谱柱：Agilent J&W-GC 型30 m×0.53 mm× 1.00 m 硅烷化玻璃柱；检测器温度为250 ℃，进样口温度240 ℃，柱温起始温度40 ℃，以10 ℃/min 升温至60 ℃，保持0 min，再以20 ℃/min升温至120 ℃，保持0 min，再以40 ℃/min 升到215 ℃，顶空55 ℃，加热时间40 min；载气为N2、H2和空气，流速分别设置为30 mL/min、45 mL/min、450 mL/min；FID 耦合火焰离子化检测器，进样量：1 μ L，进样时间9.38 min。乙醇出峰时间为3.39 min/L，乙醛出峰时间为1.35 min/L。

1.2.4 数据分析

用Excel 分析处理数据，组间检验采用Anvoa检验，所有实验数据均为3 个平行试验的平均值，用平均值±标准误差(Standard error,SE)表示；图表由Prism 绘制。

2 结果与分析

2.1 酒体主要成分含量分析

通过理化指标检测对5 款青梅果酒中主要成分进行定量分析，结果如表4 所示。由表4 可知，2#酒样中多酚物质含量远高于其余4 款酒样，1#酒样中二氧化硫、甲醇和氰化物含量远高于其余4 款酒样，4#酒样中氨基甲酸乙酯、柠檬酸含量远高于其余4 款酒样，5#酒样中琥珀酸远低于其余4 款酒样，1#和3#酒样中的酒石酸和硝酸根的总含量远高于其余3 款酒样，3#和4#酒样中苹果酸的含量远高于其余3 款酒样，2#酒样中乙醛含量远低于其余4 款酒样，5#酒样中糠醛含量远高于其余4 款酒样，4#酒样中乙缩醛和苯甲醛的含量远高于其余4 款酒样，3#酒样中丙酮的含量远高于其余4 款酒样。

表4 酒体主要成分定量分析检测结果

2.2 酒精代谢水平分析

乙醇进入人体后随血液流经肝脏，被乙醇脱氢酶氧化为乙醛，该过程会导致血液中乙醛的累积。乙醛再被乙醛脱氢酶转化为乙酸，最终乙酸被代谢为二氧化碳和水[12-13]。当血液中乙醇浓度超过一定限度时，血流量增加而代谢作用下降，造成乙醇在脑中不能及时代谢排出，引起头痛、头晕。乙醛会使人心跳加速，血压升高，嗓子发干，头晕头痛[14]。酒精代谢产物乙醛如果在体内大量积累未转化，容易引起“上脸、头疼”的不舒适反应。

采用气相色谱测定血清中乙醇以及乙醛含量。根据图1 灌胃2 h 后血清中残余酒精积累量可知，酒精代谢慢即醉酒度高的酒依次是4#、2#、5#、1#、3#。根据图2 灌胃2 h 后血清乙醛积累量结果可知，乙醛积累量从高到低依次是4#、2#、5#、1#、3#。

图1 灌胃2 h 后残余酒精积累量

图2 灌胃2 h 后血清乙醛积累量

根据血清未代谢酒精水平和酒精代谢产物乙醛积累水平得到的醉酒度和醒酒度综合分析，5 款青梅果酒整体饮后舒适性从高到低依次是3#、1#、5#、2#、4#。

2.3 影响青梅果酒饮后舒适度酒体关键成分线性回归模型预测

根据酒体主要成分含量（2.1）和酒精代谢水平（2.2），建立多元线性回归模型，预测影响青梅果酒饮后舒适度的酒体关键成分，结果如图3 所示。

图3 影响青梅果酒饮后舒适度酒体关键成分多元线性回归预测

由图3a 可知，与饮后舒适度成负相关的酒体成分有总多酚(Slope=-2054，R2=0.6917)、氨基甲酸乙 酯 EC(Slope=-49.88，R2=0.9279)、氰化物(Slope=-2449，R2=0.3939)、甲醇(Slope=-160.9，R2=0.13330)，二氧化硫(Slope=-9.065，R2=0.03)。除二氧化硫外，其他成分均具有显著差异。甲醇和氰化物在1#中含量较高，极为显著。

由图3b 可知，与饮后舒适度成极为显著负相关的酒体成分是柠檬酸(Slope=-11274，R2=0.4838)；与舒适度成正相关的酒体成分是琥珀酸(Slope=1998，R2=0.1725)，酒石酸+硝酸根(Slope=1285，R2=0.01845)，苹果酸(Slope=990，R2=0.1221)，其中显著的是琥珀酸和苹果酸。根据含量，综合分析其主要作用的负性成分是柠檬酸。

由图3c 可知，与饮后舒适度成正相关的酒体成分是异丁醛(Slope=0.9329，R2=0.6981)、丙酮(Slope=15.30，R2=0.6773)，其中显著的是丙酮。与饮后舒适度成负相关的酒体成分是乙醛(Slope=-13.22，R2=0.08)、苯甲醛(Slope=-17.81，R2=0.6697)、丙醛(Slope=-0.5576，R2=0.05)、糠醛(Slope=-3.23，R2=0.02)、乙缩醛(Slope=-5.02，R2=0.1456)、3-羟基-2-丁酮(Slope=-0.88，R2=0.005)、3-甲基吡嗪(Slope=-1.098，R2=0.0737)，其中显著的是乙醛。

3 结论

本研究选用了生理生化层面的基本评价指标，即酒精代谢水平进行分析，通过该指标可以对酒体的饮后舒适度进行评价[15]。舒适度较好的酒具有酒精代谢快即血清酒精积累量低及酒精代谢产物乙醛积累量低的特点。结合酒体主要成分含量，建立多元线性回归模型，综合分析潜在显著性酒体成分在青梅果酒中的含量，确定影响青梅果酒饮后舒适度的关键酒体成分，按照影响负性程度可以分为关键成分和主要成分两大类，其中，关键成分包括甲醇和氰化物，主要成分包括氨基甲酸乙酯、二氧化硫、柠檬酸、醛类。

甲醇的危害主要是对人体的中枢神经系统、眼睛以及酸碱平衡造成影响，例如会引起人头晕乏力、视物模糊、视力减退、嗜睡等情况，甲醇在体内分解较慢，有蓄积作用，视神经对甲醇的毒性很敏感，7～8 mL 即可引起失明，30～100 mL 可能致死。氰化物对人体的伤害主要是神经方面的，可能会导致中枢神经系统迅速丧失功能，继而使人体出现呼吸肌麻痹、心跳停止、多脏器衰竭等症状而中毒，还可能引起后续的致癌反应[16-17]。氨基甲酸乙酯是葡萄酒发酵过程中产生的不良代谢产物，是公认对人体有害的物质，主要由尿素和乙醇反应形成，其次由氨甲酰磷酸和瓜氨酸与乙醇反应生成[5，18]。二氧化硫SO2是一种食品添加剂，葡萄酒酿造过程中添加少量二氧化硫，可防止变质，但必须严格控制用量。在体内SO2首先被转化为亚硫酸盐，亚硫酸盐被亚硫酸盐氧化酶(SO)氧化成无毒的硫酸盐，通过尿液排出体外。长期摄入过量的亚硫酸盐会造成呼吸困难、呕吐等症状，还可能会破坏维生素B1，影响生长发育。根据GB 15037—2006 葡萄酒规定，柠檬酸在葡萄酒中限量不超过2 g/L。长期食用含柠檬酸的食品，有可能导致低钙血症，并且会增加患十二指肠癌的几率。儿童表现有神经系统不稳定、易兴奋，大人则为手足抽搐、肌肉痉挛、感觉异常、瘙痒及消化道症状等。人体吸收醛类后，会引起交感神经兴奋，有害心肌，使血压升高，还会刺激黏膜系统。如酒中醛类含量过高，饮用后会造成口干舌燥，喉咙痛和胃痛[19-20]。

基于青梅果酒饮后舒适度酒体关键成分研究，初步确定影响青梅果酒饮后舒适度的关键酒体成分包括甲醇、氰化物、氨基甲酸乙酯、二氧化硫、柠檬酸及醛类。本项目研究结果可为青梅果酒产品酒体设计以及产品品质提升提供理论和数据支撑。企业可以通过工艺调整如加强原料批次源头污染物控制，建立工艺控制规范，以及加强发酵过程控制等有效措施，进一步降低负性成分含量，从而生产出品质更好，饮后舒适度更佳的青梅果酒产品。