产四甲基吡嗪菌种的筛选及在酿酒中的应用研究

彭奎，张磊，陈波，刘新宇，杜鹏程，刘念，刘义，王超凯，李觅，常少健，张蓓蓓，杨天涯，甘元甲，冯霞*

（1.四川省食品发酵工业研究设计院有限公司，四川成都 611130；2.四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺 646523；3.新疆伊力特实业股份有限公司，新疆伊犁 835800；4.四川远鸿小角楼酒业有限公司，四川巴中 636400；5.崇州市天宫酒厂，四川崇州 611230；6.四川佳乐酒业股份有限公司，四川泸州 646000）

中国白酒中的四甲基吡嗪由美拉德反应生成，在制曲和堆积发酵中产生，经蒸馏带入酒中，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚的作用，赋予中国白酒以健康功能。高温制曲、高温堆积是酱香型白酒独特的生产工艺，制曲阶段和堆积过程产生的四甲基吡嗪是白酒中四甲基吡嗪的主要来源之一。四甲基吡嗪能产生类似酱香、酱油和麦酱香的风味，其他的吡嗪类物质都没有，只能认为吡嗪类物质与酱酒有关，却还没有足够有力的证据证明吡嗪及加热香气是酱香型酒的主体香气物质[1-4]。

酱香型白酒的生产周期为一年，在端午节期间开始制曲，重阳节期间下沙（投粮），经历九次蒸煮，八次发酵，七次取酒，再经过分型定级，才能封坛入存，整个过程需要经历一年的时间。针对酱香型白酒在生产上的投资大、工艺复杂、生产周期长等特点，开发出一种微生物强化菌剂，用于酱香型调味酒的生产，对于缩短生产周期和创新生产工艺，研发出独有的酱香风格白酒有着重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：酱香型白酒堆积糟醅样品5 个，高温大曲样品3 个。

编号：LJ-4-0：第四次堆积表面糟醅，2019 年样品；LJ-4-30：第四次堆积距表面30 cm 糟醅，2019 年样品；LJ2-4-0：第四次堆积表面糟醅，2020年样品；LJ2-4-30：第四次堆积距表面30 cm 糟醅，2020 年样品；LJ2-4DX：第四次堆积堆心糟醅，2020年样品；DQB：白色大曲；DQH：黑色大曲；DQHuang：黄色大曲。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物分离

将采自酱香型白酒第四次堆积酒糟的两个样品LJ-4-0、LJ-4-30 加水混匀，经80 ℃加热20 min后稀释涂琼脂培养基平板，37 ℃培养48 h。挑取单菌落平板划线，24 h 后再挑取单菌落于斜面培养24 h 后保存。LJ-4-0 样品挑菌9 个，LJ-4-30 样品挑菌10 个，共分离出19 株菌种，经过分子鉴定确定为芽孢杆菌。所得菌种通过菌落及细胞图像采集、分子鉴定后制成冻干管保藏于四川省微生物资源共享平台菌种保藏中心。

1.2.2 产酱香风味物质的菌种筛选

麸皮培养基：麸皮过40 目筛，称取10 g 装入500 mL 三角瓶中，加水190 mL，纱布封口，121 ℃灭菌20 min。接入培养8 h 的菌液5 mL，36 ℃±1 ℃，160 r/min 培养9 d，测定四甲基吡嗪、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、糠醛4种风味物质含量。

样品预处理：发酵液5000 r/min 离心，取上清液5 mL，加NaCl 1.4 g 至饱和，涡旋振荡，加入2 mL二氯甲烷溶剂，涡旋萃取1 min，6000 r/min 离心5 min，取下清液，0.45 μ m 膜过滤，进行GC-MS 分析。取4 轮次堆积酒糟（430105）、6 轮次堆积酒糟(6105、694）及大曲（DQB、DQH、DQHuang)作对照，灭菌的麸皮培养基（0）做空白。

复筛利用高粱糖化液为培养基，接入培养8 h的菌液5 mL，36 ℃±1 ℃，160 r/min 培养9 d。测定风味物质四甲基吡嗪、糠醛两种风味物质含量。

验证试验方法：利用合成培养基与高粱糖化液发酵；设置静置（低氧）与振荡（高氧）培养方式；前期高温（40 ℃，3 d），后期低温（36 ℃，6 d）发酵。

1.2.3 宏基因组测序分析

利用宏基因组测序分析。

1.2.4 模拟堆积发酵试验

利用第7 次堆积后的酒糟+高粱进行模拟堆积试验。菌种LJ-02 添加到蒸馏取酒后的酒醅中，加入10 %高粱，菌种添加量为2 ‰，置于培养箱模拟堆积发酵。前3 d 温度由10 ℃逐渐升至45 ℃，降至35 ℃保持27 d。添加方式分别为：菌液，滤液（0.45 μ m 过滤菌液），菌体（离心，洗涤3次）。

1.2.5 中试车间生产试验

菌种LJ-02接01号液体培养基，37 ℃，180 r/min培养36 h。第二轮蒸酒后，酒糟摊晾，加入酒曲，实验组加5 ‰菌液，混匀后堆积，温度升至45 ℃后入窖1 个月；入窖1 个月酒糟加入适量糠壳后蒸酒，接酒随时测定酒精度，分为头酒和尾酒，当酒精度低于30%vol 时，更换容器接酒。

1.2.6 企业酿酒生产试验

实验方法：选定1 个窖池作为实验窖，按照现有生产工艺（1 窖投粮20 吨，22甑），选择1 甑堆积糟醅的量作为实验样，在堆积后入窖前，对应1 甑糟醅900 kg 的量加入9 kg 微生物强化菌剂，入窖置于上层糟醅，待发酵期结束后蒸馏取酒。对照样为现有正常生产窖池生产工艺。

2 结果与分析

2.1 微生物分离（表1、表2、图1）

表1 堆积糟醅和高温大曲样品分离微生物菌株和计数表

图1 LJ-4-0 和LJ2-4-30 样品菌落

表2 LJ-4-0 和LJ-4-30 样品分离微生物菌落形态

表3 原酒样品类型和来源

大曲及堆积酒糟中细菌含量差异不明显，但堆积酒糟的酵母含量比大曲中高，大曲中霉菌含量比堆积酒糟含量高。

2.2 产酱香风味物质的菌种筛选

从图2 可以看出，菌株产四甲基吡嗪及糠醛能力较强，进行复筛试验。

图2 菌种发酵液的4种风味物质含量

从图3 可以看出，利用高粱液发酵产四甲基吡嗪产量低，利用复合培养基产量高，比试验组高出5 倍多。选取菌种LJ-02、菌种LJ-04、菌种LJ-32、菌种LJ-33 号菌发酵复合培养基进行验证试验。

图3 菌种发酵液的两种风味物质含量

从图4 可以看出，静置与振荡条件下4 株菌株四甲基吡嗪产量不一样，菌种LJ-02 利用合成培养基与高粱糖化液在振荡条件下产量最高，达313.8 mg/L。菌株产四甲基吡嗪对含氧条件需求不同，利用高低温发酵方式利于四甲基吡嗪产生。

图4 不同条件下菌种发酵液的四甲基吡嗪含量

2.3 宏基因组测序分析

选取了大曲、第四次堆积表面糟醅及第四次堆积堆心糟醅3 个样品分析其中微生物群落分布，见图5—图8。

图5 细菌微生物相对丰度图

图6 细菌微生物群落分布图

图7 真菌微生物相对丰度图

图8 真菌微生物群落分布图

3 个样品细菌各分类单元在数量上差异不明显，厚壁菌门（Fimicutes）、放线菌门(Actinobacteria)与变形菌门（Proteobacteria）是堆积糟醅与大曲的共同优势菌群，但3种优势菌群数量上的差异极其显著。大曲中数量最多的菌群分别为厚壁菌门（Fimicutes）、放线菌门(Actinobacteria)与变形菌门（Proteobacteria），堆积酒糟中数量最多的菌群分别为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Fimicutes）与放线菌门(Actinobacteria) 。和堆积酒糟中优势菌群的差异不显著。

3 个样品各真菌分类单元在数量上差异极其显著，大曲中各分类单元数量上最少，其次为堆积中心糟醅，数量最多的为堆积表面糟醅。3 个样品真菌的共同优势种群为子囊菌门(Ascomycota)。

2.4 微生物功能菌剂的试验研究

2.4.1 模拟堆积发酵试验

由图9 可知，四甲基吡嗪产量最高为加曲加菌液组，达到376.4 mg/L，最低为不加曲对照57.9 mg/L。加曲组比不加曲组四甲基吡嗪产量高，加菌种比不加菌种四甲基吡嗪产量高，加滤液比单加菌种四甲基吡嗪产量高，加菌液比单加菌种和滤液四甲基吡嗪产量高（不加曲情况相反），加曲和加菌液对四甲基吡嗪产量有相互促进作用。

图9 菌种LJ-02 模拟堆积发酵的四甲基吡嗪含量

图10 菌种LJ-02 中试试验的四甲基吡嗪含量

图11 实验及取样示意图

2.4.2 中试车间生产试验

经中试试验，加菌组比不加菌组四甲基吡嗪含量高，尾酒中四甲基吡嗪含量比头酒中高，酒体中的四甲基吡嗪含量比酒糟中含量高。添加筛选的菌种LJ-02 比不添加四甲基吡嗪含量高，说明菌种LJ-02 在酱香酒发酵过程中有助于四甲基吡嗪含量的提升。

2.4.3 企业酿酒生产试验

对原酒样品进行色谱分析（酯、醇、酸、四甲基吡嗪、糠醛、4-乙基愈创木酚等），对比分析实验样与对照样的差异。

从表4 可以看出，实验窖A 上层糟醅（添加9 kg微生物强化菌剂）产酒的乳酸乙酯、四甲基吡嗪含量最高，相比于现有生产工艺，增幅明显，但糠醛含量有所下降。

表4 酿酒生产实验的部分指标对比

3 结论

在酱香型白酒高温大曲、堆积糟醅分离筛选出产四甲基吡嗪风味物质的功能性菌种1 株，菌种编号LJ-02，为芽孢杆菌，耐高温、耐酸，菌种保藏编号SICC1.1847。将功能微生物制备成菌剂后进行模拟堆积、中试试验、酿酒生产研究，发现其对四甲基吡嗪含量提高有明显影响。