资源化利用牡蛎壳粉去除铜绿微囊藻*

钱凯荣 张欣怡 陈斌斌 王 敏 贾 阳 张 和 肖 鹏 李仁辉 马增岭 秦文莉

(温州大学生命与环境科学学院,浙江 温州 325035)

水体富营养化造成的蓝藻水华问题是世界环境工作者所面临的共同难题。我国太湖、巢湖、滇池等大型湖泊每年都会发生蓝藻水华。因此,蓝藻水华成为了水网密集地区制约社会经济健康发展的关键问题[1-2]。

治理蓝藻水华的方法有化学除藻法[3-4]、物理除藻法[5]和生物除藻法[6]412。化学除藻法主要依靠化学除藻剂[7],但过量的化学除藻剂进入水中又会对水生生物造成风险[8]。物理除藻法通过人工或机械打捞将藻细胞与水体分离,对于大范围的蓝藻水华,治理成本过高[9]。植物的化感作用除藻是近些年的生物除藻研究热点,主要是通过植物释放的分泌物阻止藻细胞生长[6]413,但外源性化感物质是否会对水生动植物产生危害尚不确定。因此,探寻一种低成本且生态友好的蓝藻水华治理方法仍是当前需要研究的一个重要课题。

牡蛎属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目,是世界性分布物种[10],对海洋净化起着至关重要的作用。牡蛎在世界海水养殖业中占有重要地位,目前产量最大的是中国。《2021中国渔业统计年鉴》显示,中国的牡蛎海水养殖产量达到了523万t,其中占牡蛎总质量2/3的牡蛎壳堆积成了新的污染源,所以如何将牡蛎壳资源化利用十分必要。牡蛎壳的物理结构包括角质层、棱柱层、珍珠层,主要的是棱柱层,呈叶片状,含有大量2～10 μm的微孔[11],经过煅烧后的牡蛎壳可以形成多孔结构,具有很好的吸附性能[12]。氮磷是水体富营养化的主要驱动因子。HUH等[13]发现有氧煅烧后的牡蛎壳可使水体总磷(TP)与总氮(TN)下降90%以上,并且含藻水体透明度得到提升。XING等[14]87发现,Ca2+影响牡蛎壳细胞膜通透性,从而影响其对轮纹病菌和立枯丝核菌的抗菌性。牡蛎壳中除了含钙物质外,甲壳素也是牡蛎壳资源化利用的重要物质,因为甲壳素对多种菌具有抑制作用[15]。甲壳素的衍生产物壳聚糖又常被用作絮凝材料的改性剂或辅助剂,可提升对藻类的去除效率[16]。ZOU等[17]将壳聚糖与粉煤灰制作成一种复合材料,对铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的去除率达到98.5%。因此,含钙和甲壳素的牡蛎壳可能是控藻的理想材料。

本研究首先对牡蛎壳粉进行预处理,然后研究其控藻效果,并且探讨牡蛎壳粉对铜绿微囊藻的控藻机制,旨在资源化利用牡蛎壳粉去除铜绿微囊藻,为水生态治理提供新的技术。

1 方 法

1.1 牡蛎壳粉的制备

收集浙江省宁波市象山港畔的牡蛎壳,用蒸馏水清洗3次,121 ℃灭菌30 min,60 ℃烘干至恒重,用微型粉碎机(FW100,功率460 W)研磨成粒径60～300目的牡蛎壳粉。

1.2 铜绿微囊藻培养

铜绿微囊藻FACHB-905购自中国科学院水生生物研究所,用BG11培养基在智能光照培养箱(PGX-600B)中以光暗比12 h∶12 h、温度25 ℃、光量子通量密度40 μmol/(m2·s)培养。采用继代培养的方式保持指数阶段生长。

1.3 牡蛎壳粉的预处理

将牡蛎壳粉在马弗炉(YFX12/10Q-GC)中分别从室温以2 ℃/min升温至200、400、600、800、1 000 ℃进行3 h的有氧煅烧与无氧煅烧后,冷却,不同温度下有氧煅烧组分别标记为CO200、CO400、CO600、CO800、CO1000,无氧煅烧组分别标记为CN200、CN400、CN600、CN800、CN1000。另外,将牡蛎壳粉放入质量分数10%的盐酸中浸泡24 h,再进行无氧煅烧,得到酸处理无氧煅烧组,分别标记为CAN200、CAN400、CAN600、CAN800、CAN1000;将100 g牡蛎壳粉放于500 mL锥形瓶中,加入质量分数6%的氢氧化钠溶液250 mL,25 ℃恒温水浴搅拌(250 r/min)12 h,过滤干燥,再加入到300 mL质量分数5%的盐酸中搅拌(250 r/min)6 h,抽滤干燥,加入至150 mL质量分数6%的氢氧化钠溶液中,并加入50 mL质量分数95%的乙醇,25 ℃水浴搅拌(250 r/min)2 h,冷却离心洗涤干燥,无氧煅烧,得到脱乙酰处理无氧煅烧组,分别标记为CHN200、CHN400、CHN600、CHN800、CHN1000。未经任何预处理的牡蛎壳粉标记为C0。所有牡蛎壳粉放置于干燥环境中密封保存。

1.4 实验设计

在经过高压灭菌锅灭菌的1 L锥形瓶中加入500 mL铜绿微囊藻藻液,初始藻密度为1×106个/mL,分别加入0、0.25、0.50、1.00、2.00 g/L不同预处理的牡蛎壳粉,每组均做3个重复,每天用血球计数板在显微镜(DS-Ri2,Nikon)下观测藻密度,并计算抑制率[18]。取1 d内可达100.00%抑制率的牡蛎壳粉进行抑藻速率测定。

选择控藻效果较好的牡蛎壳粉,将其通过300、160、100目的不锈钢筛后,用量定为0.25 g/L再进行重复实验,同时每日测量藻液pH,考察不同粒径牡蛎壳粉对铜绿微囊藻生长的影响。

2 结果与讨论

2.1 不同预处理的牡蛎壳粉对铜绿微囊藻生长的影响

未经任何预处理的牡蛎壳粉对铜绿微囊藻的抑制效果较差。有氧煅烧的牡蛎壳粉随着煅烧温度升高,对铜绿微囊藻的抑制效果增强,800 ℃为有氧煅烧牡蛎壳粉的控藻效果转折点,用量只要0.25 g/L第1天的抑制率即可达到91.11%,第7天升至99.46%。而1 000 ℃煅烧后用量0.25 g/L的条件下第3天抑制率就可达到100.00%。

与有氧煅烧的牡蛎壳粉类似,800 ℃也是无氧煅烧牡蛎壳粉的控藻效果转折点,但与有氧煅烧的牡蛎壳粉相比,无氧煅烧的牡蛎壳粉对铜绿微囊藻的抑制能力有所下降,相同煅烧温度下,无氧煅烧的牡蛎壳粉需要更大的用量才能达到与有氧煅烧的牡蛎壳粉相近的抑制率。YONG等[19]发现,牡蛎壳粉在约800 ℃煅烧条件下,活性较低的CaCO3会转化为活性较高的CaO。CaO溶于水产生Ca2+,Ca2+通过静电作用吸附于藻细胞表面,改变藻细胞膜内外渗透压,从而抑制细胞生长[14]89。这可能就是800 ℃为有效抑藻的煅烧温度转折点的原因。

相同温度煅烧后,之所以无氧煅烧的牡蛎壳粉所需用量比有氧煅烧多,一方面是因为无氧煅烧还留有牡蛎壳粉中的有机质成分,降低了CaO含量[20];另一方面是因为牡蛎壳粉中的有机质成分含有丙氨酸、精氨酸和亮氨酸[21],而这些氨基酸是铜绿微囊藻生长能够吸收的氮源[22],因此反而起到促进了铜绿微囊藻生长的作用。

综上,煅烧可以提高牡蛎壳粉的抑藻效果,煅烧产生CaO是抑制铜绿微囊藻生长的主要因素,有氧煅烧的效果更好,温度1 000 ℃、用量0.25 g/L处理3 d铜绿微囊藻抑制率可以达到100.00%。

脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉对铜绿微囊藻的抑制率整体表现出随着煅烧温度升高,抑制率下降的趋势,而且CHN1000放入水中,会使水体严重着色,无法进行实际应用。酸处理无氧煅烧的牡蛎壳粉与脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉类似,也表现出随煅烧温度升高,对铜绿微囊藻的抑制率呈下降趋势。不过,整体上脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉的抑藻效果略优于酸处理无氧煅烧的牡蛎壳粉,这可能与甲壳素是否脱乙酰有关。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物,而壳聚糖的高抑藻率早已得到证实[23],原因是壳聚糖分子中含有大量氨基,所以具有很好的溶解性和化学活性[24]。LIU等[25]研究证实,壳聚糖的氨基通过与细菌表面结合而抑制细菌生长。吴小勇等[26]解释,壳聚糖堆积在细菌细胞表面,影响其代谢。TANG等[27]将壳聚糖和甲壳素进行无氧煅烧,发现温度过高,甲壳素解聚,壳聚糖氨基大分子被破坏,这也就导致了脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉和酸处理无氧煅烧的牡蛎壳粉随着煅烧温度提升,抑藻效果下降的原因。

综上,酸处理无氧煅烧的牡蛎壳粉和脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉的抑藻因素以壳聚糖和甲壳素为主,特别是壳聚糖,但其抑藻效果不如CaO。

表1总结了不同预处理的牡蛎壳粉对铜绿微囊藻生长的最高抑制率及其所对应的最低用量和时间。可以发现,1 000 ℃有氧煅烧的牡蛎壳粉用量(0.25 g/L)最少,只要3 d就可以达到100.00%的抑制率,可以说是效果最好的牡蛎壳粉。

表1 牡蛎壳粉对铜绿微囊藻生长的最高抑制率及其所对应的最低用量和时间Table 1 The maximum inhibition rate of oyster shell powder on the growth of Microcystis aeruginosa and the corresponding minimum dosage and time

对于部分1 d内可以达到对铜绿微囊藻抑制率100.00%的牡蛎壳粉进行了抑藻速率测定,结果见图1。CO800与CO1000在1.00 g/L的用量下能够在40 min内达到100.00%的抑制率,而用量提升到2.00 g/L,15 min内即可达到100.00%的抑制率。对比CO800与CO1000在同等用量下的抑藻速率发现,煅烧温度对抑制趋势的影响不大,表明在800℃下有氧煅烧即有大量CaO生成。CN800在2.00 g/L的用量下能够在240 min内达到100.00%的抑制率,CN1000在0.50 g/L的用量下也是在240 min内达到100.00%的抑制率,表明煅烧温度升高,对于无氧煅烧可以增加CaO含量。而CN1000的用量增加至1.00、2.00 g/L,分别可在40、15 min内达到100.00%的抑制率。CAN200与CAN400在2.00 g/L的用量下分别需要480、120 min才能达到100.00%的抑制率。CHN200与CHN400在2.00 g/L用量下均在120 min达到100.00%的抑制率,而CHN200在1.00 g/L的用量下则需要1 440 min才能达到100.00%的抑制率。总之,提升牡蛎壳粉用量能够显著提升抑藻速率,在同等煅烧温度及用量下,有氧煅烧的牡蛎壳粉抑藻效果最佳。

图1 1 d内达100.00%抑制率的牡蛎壳粉抑藻速率Fig.1 The inhibition velocity of oyster shell powder reached 100.00% inhibition rate within 1 d

综上所述,无氧煅烧与有氧煅烧的牡蛎壳粉抑藻效果差异主要归因于CaO含量的多少。酸处理与脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉主要抑藻因素为甲壳素和壳聚糖,壳聚糖因具有更好的溶解性与化学活性,控藻效果更优于甲壳素。无氧煅烧与有氧煅烧的牡蛎壳粉最快能在15 min内去除100.00%的铜绿微囊藻,而酸处理与脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉则至少需要120 min才能达到100.00%的抑制率。

2.2 不同粒径牡蛎壳粉对铜绿微囊藻生长的影响

由图2可知,160～300目、300目以上的CO800与CO1000都呈现出高抑制率,7 d的抑制率都达到98%以上,且都是在300目以上时抑制率最高,分别为99.95%、99.87%,而100～160目时抑制率均不到40%,表明CO800和CO1000的有效控藻粒径在160目以上。160～300目、300目以上的牡蛎壳粉表现出更高的抑制率,这是因为牡蛎壳粉的CaCO3粒径主要分布在1～100 μm[28]。

图2 不同粒径牡蛎壳粉对铜绿微囊藻生长的影响Fig.2 Effects of oyster shell powder with different particle sizes on growth of Microcystis aeruginosa

综上所述,粒径会影响牡蛎壳粉对铜绿微囊藻的抑制效果,CO800和CO1000有效控藻成分粒径应该大于160目。牡蛎壳粉还会提升藻液pH,并且粒径与藻液pH表现为负相关性。

注:空白组指不加入牡蛎壳粉的纯藻液。

3 结 论

(1) 牡蛎壳粉是有效的抑藻材料,有氧煅烧预处理可以提高牡蛎壳粉的抑藻效果,而且效果优于无氧煅烧、酸处理无氧煅烧和脱乙酰处理无氧煅烧。1 000 ℃有氧煅烧的牡蛎壳粉抑制率达到100.00%的最少用量只要0.25 g/L。800 ℃有氧煅烧的牡蛎壳粉2.00 g/L的用量下抑藻率达到100.00%最快只要15 min。

(2) 无氧煅烧与有氧煅烧的牡蛎壳粉主要抑藻因素是CaO。酸处理与脱乙酰处理无氧煅烧的牡蛎壳粉主要抑藻因素是甲壳素和壳聚糖,壳聚糖因具有更好的溶解性与化学活性,控藻效果更优于甲壳素。

(3) 牡蛎壳粉粒径越小,抑藻效果越好,CO800和CO1000的有效控藻粒径应在160目以上。