黑水虻幼虫处理餐厨垃圾过程中体内养分组成与消化酶活性变化规律的研究

王 聪,叶小梅,奚永兰,杜 静,孔祥平,王 莉,韩 挺,朱 飞,张应鹏

(江苏省农业科学研究院畜牧研究所,循环农业研究中心,农业农村部种养结合重点实验室,南京 210014)

黑水虻是一种新型资源环境昆虫,其幼虫阶段可以取食餐厨垃圾、蔬菜残体和畜禽粪便等各种有机废弃物(Chenetal., 2019; Mazzaetal., 2020)。研究表明黑水虻幼虫对于畜禽粪便、奶牛粪和猪粪的减量率可以达到50%～65%(Dieneretal., 2009; Luoetal., 2019; Matosetal., 2021)。黑水虻幼虫处理有机废弃物过程中,可以降低臭气的排放以及抑制有害微生物生长,比如大肠杆菌Escherichiacoli和沙门氏菌salmonella等(Liuetal., 2017; Schiavoneetal., 2019)。并且幼虫可以在富含重金属条件下正常完成生命周期(Lietal., 2018)。同时,黑水虻幼虫粗蛋白含量为43%～47%,粗脂肪含量为30%～34%,可以广泛应用于家禽、水产饲料的生产(Barragan-Fonsecaetal., 2019; Kawasakietal., 2019)。

国内外已经对黑水虻幼虫处理废弃物过程中的基本生理生化特征进行大量的研究。蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶等消化酶在幼虫处理废弃物过程中发挥重要作用(Bonellietal., 2019; Guerreiroetal., 2020)。但消化酶活性和废弃物类型导致黑水虻幼虫对废弃物的转化率、减量率和其生长性能仍存在差异(Beskinetal., 2018; Giannettoetal., 2020; Nikkhahetal., 2021)。因此,本研究目的是通过测定黑水虻幼虫不同生长时期养分组成情况和消化酶活性,探索其生长过程中养分需求以及和消化酶活性变化之间的规律,为工厂化黑水虻养殖提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验用虫养殖

黑水虻新鲜虫卵孵化于恒温恒湿箱中(温度28℃、相对湿度70%),并用65%含水率的麦麸饲养至第5天作为实验用虫。

1.2 实验材料获取

餐厨垃圾从江苏省现代农业科学院食堂获取,充分粉碎混匀,含水率为75%。前期养分测定结果:餐厨垃圾的粗蛋白含量为28.34%,粗脂肪含量为36.79%,总糖为23.72%。

1.3 实验设计

每个处理组挑选200头5日龄的黑水虻幼虫置于饲养盒内[长(20 cm)×宽(10 cm)×高(6 cm)],根据预实验结果,每个饲养盒内均匀放入200 g的餐厨垃圾供黑水虻幼虫自由取食。每日随机挑选3组,将所有幼虫与物料进行分离,并用无菌水洗净,滤纸吸干水分后于-70℃保存用于后续指标测定,共30个处理组。当90%的幼虫变成预蛹时,实验停止。本次实验的环境温度为30℃,相对湿度为70%。

1.4 养分指标测定

主要测定实验样品中粗脂肪、粗蛋白与总糖的含量。粗蛋白的测定方法为采取凯氏定氮法(GB 5009.5-2010),粗脂肪测定方法为索氏提取法(GB/T 5009.6-2003),总糖测定方法参照(GB 5009.7-2016)。

1.5 消化酶活性测定

每个处理挑选生长一致黑水虻幼虫10头,用无菌水将虫体表面洗净,滤纸擦干。迅速在冰盒中取出黑水虻幼虫肠道,加入预冷的200 mM磷酸盐缓冲液,用电动研磨棒在冰上充分匀浆。将匀浆等量分装于1.5 mL离心管中,于高速离心机上4℃,10 000 r/min,离心30 min,移液枪吸取上清液为粗酶液,分装用于酶活性测定。

蛋白酶测定:用福林-酚试剂法测定酪氨酸的生成。酶活力定义:在一定条件下,1 min酶解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位,用U/mL表示。

淀粉酶测定:采用碘-淀粉比色法。酶活力定义:在一定条件下,在紫外分光光度计660 nm处测量吸光值,1 mL酶粗液每分钟分解产生酪氨酸对应吸光值增大0.001,定义为1个淀粉酶活力单位,用U/mL表示。

（3）了解各水域锚舶船及小船航行习惯，熟悉港区各水域浅滩、礁石、碍航物及岸线情况，以便恶劣天气来临时心中有数。在恶劣天气来临时，尽量避免通过通航密度大的水域或在通航密度大的水域停留。

脂肪酶测定:使用0.01 M对硝基苯棕榈酸酯并用分光光度计在610 nm处测量并与对硝基苯酚标准曲线进行比较(Winkler &Stuckmann, 1979)。脂肪酶活性用U/mL进行表示。

1.6 计算与数据分析

本研究中使用的公式如下:废弃物减量率(%)=(W1-W2/W1)×100,其中W1为初始餐厨垃圾重量(DM),W2为残渣重量(DM);生物转化率(%)=总幼虫生物量(DM)/摄入食物的重量(DM)×100。

用Microsoft Excel 2016进行数据分析,数据之间差异性分析用软件SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行处理。结果通过单因素方差分析(ANOVA)进行分析,使用Tukey’s HSD进行事后检验,以比较不同处理方法之间的显著性(P)。如P<0.05认为处理间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同生长阶段黑水虻幼虫的养分组成含量变化规律

不同生长阶段的黑水虻幼虫体内的粗蛋白、粗脂肪以及总糖含量均呈现不同的变化规律。黑水虻幼虫初始粗蛋白含量约为53.15%,逐渐下降至36.54%(表1)。老熟幼虫以及预蛹阶段,虫体粗蛋白含量约为40%(表1)。粗脂肪含量随着幼虫龄期增加而增长,其幼虫体内粗脂肪含量从7.66%上升至30.58%。黑水虻幼虫总糖含量呈现的变化规律与粗蛋白变化规律相反,即先上升再下降。可能因为生长后期,黑水虻幼虫需要分解自身大量的糖原从而满足后期变态发育的营养需求。

表1 黑水虻幼虫不同生长阶段养分组成含量

2.2 黑水虻幼虫餐厨垃圾转化效率

餐厨垃圾经过黑水虻幼虫处理后,残渣中粗蛋白、粗脂肪与总糖含量分别为31.03%、13.15%和12.78%(表2)。黑水虻幼虫对于原料中养分的转化率较低。蛋白质、油脂以及糖类的转化率分别为38.41%、29.63%和24.48%(表2)。幼虫对餐厨垃圾中养分利用率低的原因是可能转化过程中可释放出氨气,导致N元素流失,影响微生物的生理活动。通过黑水虻转化餐厨垃圾过程中物料的测定,幼虫对餐厨垃圾减量率为78.13%,而生物转化率仅为23.09%(表3)。

表2 黑水虻幼虫转化餐厨垃圾养分效率

表3 黑水虻幼虫处理餐厨垃圾的生产性能

2.3 黑水虻不同生长阶段消化酶活性变化的规律与相关性分析

对不同生长阶段黑水虻幼虫的消化酶活性进行测定。蛋白酶、淀粉酶以及脂肪酶均呈现不同的变化规律。第0～6天,黑水虻幼虫体内蛋白酶活性迅速上升至活性高峰(202.36 U/mL)。随着黑水虻幼虫龄期增加,其体内蛋白活性逐渐降低(图1)。黑水虻幼虫在生长前期需要分解大量蛋白质满足自身生长发育的需求。随着龄期增加,黑水虻通过分解糖类、淀粉类物质为后期变态发育储备能量。因此,在第0～5天,幼虫体内淀粉酶活性缓慢增加,而当第5～8天,淀粉酶活性迅速上升至605.21 U/mL(图2)。黑水虻幼虫脂肪酶活性在处理餐厨垃圾过程的前期保持增长趋势(图3)。而随着龄期增加,黑水虻幼虫停止取食,导致脂肪酶、淀粉酶活性后期开始降低。

通过对黑水虻幼虫体内养分组成与消化酶活性变化规律的相关性分析(图4～图6),黑水虻体内蛋白含量与蛋白酶没有明显相关性,因为幼虫可通过分解其它物质而合成蛋白。而幼虫总糖含量、粗脂肪含量分别与淀粉酶,脂肪酶均存在相关性。

图1 黑水虻蛋白酶活性与处理餐厨垃圾时间的关系Fig.1 Relationship between the protease activity of BSFL and the time to dispose of kitchen waste

图2 黑水虻淀粉酶活性与处理餐厨垃圾时间的关系Fig.2 Relationship between the amylase activity of BSFL and the time to dispose of kitchen waste

图3 黑水虻脂肪酶活性与处理餐厨垃圾时间的关系Fig.3 Relationship between the lipase activity of BSFL and the time to dispose of kitchen waste

图4 黑水虻蛋白酶与粗蛋白含量变化相关性分析Fig.4 Correlation analysis of protease and crude protein content of BSFL

图5 黑水虻淀粉酶与总糖含量变化相关性分析Fig.5 Correlation analysis of amylase and total sugar content of BSFL

图6 黑水虻脂肪酶与粗脂肪含量变化相关性分析Fig.6 Correlation analysis of lipase and crude fat content of BSFL

3 结论与讨论

黑水虻幼虫是一种杂食性昆虫,可以处理餐厨垃圾、畜禽粪便等有机废弃物,因此利用黑水虻处理有机废弃物是一种新型绿色处理方式(Boreletal., 2021)。研究表明,中肠是黑水虻消化吸收的主要场所,其中主要的消化酶为蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等(Chenetal., 2010; Schiavoneetal., 2019)。研究表明消化酶活性变化的规律是昆虫对于不同营养需求的直接反应(Leeetal., 2014)。目前对黑水虻体内消化酶变化规律与其养分需求之间的联系的研究较少(Chenetal., 2010; Oonincxetal., 2015)。因此,本研究主要通过幼虫饲喂实验,明确黑水虻幼虫养分组成与消化酶活性变化的关系。

通过对实验样品测定,幼虫粗蛋白在第15天时约占40.73%。本研究结果与前人研究黑水虻幼虫饲喂实验的研究结果一致,黑水虻幼虫阶段的粗蛋白在34%～42%之间(Dieneretal., 2009; Mazzaetal., 2020)。用猪粪和家禽粪便饲养的黑水虻的蛋白质含量分别约为43.2%和41%(Nguyenetal., 2015; Ragossnig &Ragossnig, 2021),利用食品加工的副产物饲养黑水虻幼虫,可获得38%～46.3%的粗蛋白(Ritika, 2019; Tanetal., 2021)。蛋白质是昆虫主要营养物质之一,饲料中蛋白质含量不足会导致昆虫前期发育异常。蛋白酶广泛存在于生物体内,参与昆虫主要的生理生化过程,有助于促进对食物的分解和吸收(Santanaetal., 2017)。黑水虻幼虫处理餐厨垃圾过程中,蛋白酶活性迅速上升,在生长初期时达到高峰,然后逐渐下降。黑水虻在发育前期通过蛋白酶将蛋白质水解成氨基酸,由虫体吸收,循环并再次合成蛋白质,并且蛋白质有助于提高幼虫生长前期的免疫力(Santanaetal., 2017; Zhengetal., 2021)。

本研究结果显示淀粉酶呈现先缓慢上升再迅速上升,最后下降的变化规律。淀粉酶能促进黑水虻幼虫对能源性物质的分解与储存,并且当物料中的蛋白质或者氨基酸含量不足时,淀粉可以通过一系列代谢反应,合成饲料中所缺乏的蛋白质或者氨基酸(Guerreiroetal., 2020)。本研究结果与已报道文献相似,即黑水虻生长中后期的淀粉酶活性高于生长前期(Santanaetal., 2017)。昆虫幼虫在中后期增加淀粉的摄入主要作为变态发育期的能量来源,而幼虫阶段对淀粉的摄取也对成虫的繁殖起着至关重要的作用(Greggetal., 1990)。

黑水虻体内粗脂肪的积累与饲养物料类型有关系。黑水虻幼虫取食猪粪后,其粗脂肪含量为28%,利用家禽粪便饲养的幼虫粗脂肪含量为34.8%(Beskinetal., 2018; Chenetal., 2019),利用食品加工副产物饲养的粗脂肪含量约为42% (Chengetal., 2017)。脂肪作为昆虫体内重要储能形式之一,也是虫体细胞膜重要构成物质,以及激素合成的前体物质。餐厨垃圾转化过程中,因为物料中油脂含量过高,所以黑水虻幼虫生长前期脂肪酶保持较高的活性(Giannettoetal., 2020),并且黑水虻幼虫发育中后期,脂肪酶将脂质分解成脂肪酸,为变态发育以及成虫羽化提供能量基础(Colmanetal., 2012)。餐厨垃圾转化过程中,黑水虻幼虫分解过量淀粉物质转化为脂肪等物质储存于体内,为后期变态发育提供能量。因此通过对不同生长阶段幼虫养分含量测定,其粗脂肪含量一直保持上升规律。而黑水虻预蛹阶段,幼虫停止取食从而导致脂肪酶活性下降。

由于废物种类不同,黑水虻幼虫消化有机废物的生理过程也不同。因此,本研究可以为黑水虻工厂化养殖提供理论指导,以及明确15日龄黑水虻幼虫可以作为水产饲料的最佳收获时间。