基于网络药理学探讨姜黄素对砷诱导心脏损伤的作用机制及PI3K/AKT信号通路验证

李瑞平 雷雨歌 李 健 张 越

沈阳医学院公共卫生学院，辽宁沈阳 110034

砷作为已知的人类致癌物，广泛存在于自然界 中[1]。通过环境污染和职业接触进入体内，对人体皮肤、神经系统、心血管、肝脏及肾脏等器官有明显的损伤[2]。砷在体内代谢过程中产生多种自由基和非自由基产物，引起细胞紊乱，直接攻击细胞或诱发脂质过氧化物引起机体氧化与抗氧化代谢失调，造成氧化应激损伤[3]。氧化应激的产生使得大量的ROS 产生，造成细胞的损伤和凋亡[4]。姜黄素（Cur）是姜黄（姜黄科）根茎的主要Cur 类化合物，传统上被用来治疗咳嗽、黄疸、感冒、肝脏疾病和炎症性疾病，被认为是一种安全性能高、疗效好、副作用小的药物，可作为糖尿病及心血管并发症的治疗药物[5]。但Cur 对砷诱导心脏损伤的具体机制尚不明确，值得进一步研究。本研究旨在通过网络药理学方法探索Cur 抗砷诱导心脏损伤的潜在靶点和途径。以砷处理的H9C2 细胞作为体外心肌细胞模型，验证Cur 对细胞凋亡的调控作用及其机制。结果表明，Cur 至少部分地通过激活PI3K/AKT 通路来减轻亚砷酸钠（NaAsO2）介导的细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 Cur靶点的预测

从本草组鉴HERB 数据库（http://herb.ac.cn/）中筛选Cur 的潜在靶点，该数据库是中药高通量实验和参考数据库。

1.2 砷致心脏损伤疾病靶点预测

从GeneCard、在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库获得疾病相关靶点，关键词为砷诱导心脏损伤，并去除两个数据库的重复靶点。

1.3 疾病和药物共同靶点的筛选

将药物和疾病的靶点输入Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平台，得到药物和疾病的交集靶点及韦恩图。

1.4 交集靶点蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将药物与疾病的交集靶点输入String 数据库，将物种设定为人“Homo Sapiens”，最低相互作用阈值设为“medium confidence（＞0.700）”，将其导入Cytoscape 3.7.2 软件，绘制PPI 网络。Cytohubba 是Cytoscape 软件中寻找核心靶点的一个插件，用于发现复杂网络中的关键目标[6]。利用Cytohubba 中的五种算法，节点连接度（Deg）、最大集团中心性（MCC）、最大领域分量（MNC）、边缘渗透分量（EPC）与Closeness（Clo）选取前5 个基因，根据5 种算法筛选后的基因取交集，如果同一基因同时能在五种算法之中，则认为是核心基因。

1.5 基因功能和信号通路的富集分析

GO 是注释基因及其表达产物的常用方法，由生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3 部分组成，运用DAVID 数据库对疾病和药物的交集靶点进行GO 功能分析，说明其在基因功能中的作用。对Cur 和砷导致的心脏损伤疾病的交集靶点进行KEGG 信号通路富集分析，从而了解Cur 治疗该疾病发生改变的关键信号通路。

1.6 关键靶点与Cur的分子对接

将排名前三的靶点与Cur 进行分子对接，通过PubChem 数据库下载成分的结构，通过PDB 数据库下载排名靠前的核心靶点结构，将成分及靶点结构通过AutoDock 软件进行加氢、计算电荷处理后进行分子对接，结合能最低的结构为最优结构，通过Open Babel GUI 软件将对接结果的.pdbqt 格式转化为.pdb 格式，最后使用PyMOL 软件对图像进行处理分析。

1.7 细胞培养

H9C2 细胞购自中国科学院，NaAsO2来自美国Sigma 公司。

1.8 细胞活力

将H9C2 心肌细胞接种与96 孔板中，接种密度为5×104个/ml，铺板24 h 后对细胞进行NaAsO2染毒实验。实验的分组设置为：对照（Con）组、NaAsO2组（6、8、10 μmol/L），NaAsO2（6 μmol/L）与Cur组（2.5、5、7.5、10、15 μmol/L）。

1.9 荧光定量聚合酶链式反应

取大鼠心肌细胞，提取RNA 并按照反转录试剂盒（Takara）将RNA 逆转录成cDNA，以GAPDH为内参，RT-PCR 检测各因子的表达，引物序列由上海生工公司合成，以GAPDH 为参照基因。

1.10 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（± s）表示，采用t检验；P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶点的预测

从HERB 数据库中筛选出Cur 靶点152 个。以“Arsenic induces heart damage”为关键词，GeneCards数据库以“Relevance score”大于1 进行筛选，得出疾病靶点2207 个。OMIN 数据库中筛选出197 个疾病靶点。

2.2 PPI网络的构建

将筛选出来的Cur 靶点与疾病靶点，运用VENNY 2.1 绘制韦恩图，见图1A。将两者的共同靶点导入String 数据库，根据设定条件得到PPI 网络。运用Cytoscape 3.7.2 软件导入节点信息，见图1B。其中，根据5 种算法获得5 个核心基因分别是AKT1、AMPK3、JUN、TP53、SRC。

2.3 GO和KEGG通路分析

DAVID 数据库以FDR＜0.05 对结果进行筛选，对119 个交集靶点进行GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析。共有973 个GO 术语条目，主要的GO 生物过程包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控等，表明Cur 对砷诱导的心脏损伤有抗凋亡作用。细胞组分主要与细胞质、细胞核有关。分子功能与蛋白结合与酶结合有关，揭示了蛋白质在疾病的重要性，见图2。主要KEGG 信号通路有癌症通路、PI3K/AKT 信号通路，PI3K/AKT 通路富集程度较高，有34 个靶基因，见图3。

图2 Cur 治疗砷诱导心脏损伤GO 富集分析

图3 Cur 治疗砷诱导心脏损伤KEGG 富集分析

2.4 分子对接

将Cur 与排名前3 位靶点进行分子对接，值越小表示结合活性越高，成分越容易与受体结合，所示对接结果见表1。分子与标靶蛋白的结合能均小于0，说明配体与受体均可以自发结合。分子对接图见图4。

表1 分子对接结果图

图4 Cur 治疗砷诱导心脏损伤的分子对接示意图

2.5 细胞活力

CCK8 结 果 表 明 从6 μmol/L 时 开 始，随 着NaAsO2染毒剂量增加，细胞活性下降（P＜ 0.05）。在Cur 与NaAsO2联合处理实验中Cur 浓度为2.5 μmol/L 时，细胞活性上升最显著，因此，在后续的实验选用2.5 μmol/L Cur 和6 μmol/L NaAsO2进行研究。见图5。

图5 Cur 和NaAsO2 对H9C2 细胞存活率的影响（n=6）

2.6 Cur通过PI3K/AKT信号通路在砷诱导心肌细胞中发挥抗凋亡作用

与Con 组相比，NaAsO2组Caspase-9 的mRNA水 平 升 高，AKT、BCL-2 的mRNA 水 平 降 低; 与NaAsO2组相比，Cur+NaAsO2联合组中PI3K、AKT mRNA 水平升高，Caspase-9、BAX 的mRNA 水平降低，见图6。

图6 H9C2 细胞中PI3K（A）、AKT（B）、Caspase-3（C）、Caspase-9（D）、Bax（E）、BCL-2（F）的mRNA 相对表达水平（n=3）

3 讨论

全世界有超过3 亿人口面临高砷暴露的威胁，我国因砷暴露受累人群近2000 万[7]。本研究采用网络药理学、分子对接和体外实验验证的方法，揭示Cur 对砷诱导心脏的作用机制。从数据库中选取Cur 152 个靶点，PPI 网络构建中根据5 种算法得出AKT1、MAPK3、TP53、JUN、SRC5 个核心基因发挥着重要作用。分子对接结果显示AKT1 与Cur结合活性最好。AKT1 是AKT 重要的亚型，AKT 一般指蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是PI3K 下游的主要靶点之一。PI3K/AKT 信号通路具有广泛的生物学效应，参与调节细胞分裂、增殖、凋亡、代谢等多个环节，与心血管疾病密切相关[8]。MAPK3、JUN 与Cur 结合活性较好。在人类中，MAPK3 在细胞周期进展和凋亡中起关键作用[9]。c-jun 通过促进细胞存活和抑制细胞凋亡，在低氧心肌反应中起到保护作用。GO 富集分析的生物学过程涉及细胞凋亡过程。KEGG 信号通路分析表明PI3K/AKT 信号通路富集度较高，体外实验也证实了Cur 通过激活PI3K/AKT 信号通路抑制砷处理的心肌细胞的凋亡。

PI3K/AKT 是调节心脏功能的一条重要的信号转导通路，主要通过血管内皮生长因子介导血管生成、抑制心肌细胞凋亡、重构心室、促进细胞能量代谢等方面调节心脏功能[10]，该信号在心肌细胞存活和程序性死亡的过程中发挥关键的调控作用[11]。此通路与线粒体途径细胞凋亡过程中Bcl-2 家族蛋白的活性密切相关，Bcl-2 蛋白家族是线包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax 等[12]。Caspase-9作为线粒体途径细胞凋亡的起始者，活化的Caspase-9 进一步裂解Caspase-3 和Caspase-7，凋亡过程开始[13]。研究表明，Cur 可以通过抑制心肌细胞凋亡，进而降低冠心病的发病风险[14]。Cur 可以改善糖尿病心肌病大鼠心室重构[15]。

综上所述，本研究在网络药理学的基础上，将PI3K/AKT 通路与Cur 对砷诱导心脏的保护作用联系起来，并利用体外实验验证了网络药理学的分析。通络网络药理学挖掘了潜在通路，这些通路也值得研究，但本研究未对其他通路进行验证。本研究只利用体外实验进行验证，具有一定的局限性。