腰腿痛宁胶囊通过调控炎症因子途径对兔膝骨关节炎的影响

金美英，张伟冬，王婉霖，李泉锋，赵文海，沙里泉*，崔镇海*

（1.长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117；2.长春中医药大学，长春 130017；3.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以关节软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜增生为特征的骨疾病[1]。研究[2-3]发现炎症机制在介导生物力学失调的影响方面起着核心作用，会造成关节组织生物力学的紊乱。在KOA 炎症的过程中，巨噬细胞会释放出IL-1β、IL-6 和TNF-α 等细胞因子子[4]。这些细胞因子会诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达，干扰细胞外基质（extracellular matrix，ECM），促使II 型胶原蛋白（collagen type II）降解，进而损伤关节软骨，加剧KOA 的发展[5]。目前，KOA 的治疗可大致分为减少诱发的危险因素、物理方式、关节内治疗、手术治疗和替代治疗[6]。非甾体抗炎药（NSAIDs）和对乙酰氨基酚（Paracetamol）通常被认为是治疗骨关节炎的首选药物[7]。然而非甾体抗炎药应谨慎用于胃肠道疾病患者，有造成消化道出血、穿孔等风险[8]。因此，安全性高、副作用小的中草药是防治骨性关节炎的较好选择。本团队在前期临床试验中已经验证腰腿痛宁胶囊治疗KOA 的确切疗效。此次研究旨在观察木瓜蛋白酶（papain）诱导的兔早期 KOA 模型中炎症因子的水平，研究腰腿痛宁胶囊对木瓜蛋白酶诱导的兔早期 KOA 的保护作用。

1 动物与材料

1.1 动物

新西兰大白兔20 只，体质量（2.01±0.15）kg，购于哈尔滨市道里区骏琦养殖场[生产许可证编号：SCXK（黑）2021-004]。由黑龙江省实验动物质量监督检验单位检测，实验场地在长春中医药大学动物实验中心。饲养室条件：温度16 ～26℃，湿度40%～70%。饲养时间：上午8:30，下午3:30。实验过程中严格遵守善待动物规定，最大限度减少动物的痛苦，减少动物使用数量。本实验经过长春中医药大学动物伦理委员会审核批准（动物伦理审批号：2020226）。

1.2 药物及试剂

腰腿痛宁胶囊（吉药制备字：Z20200131000，长春中医药大学附属医院），处方成分：熟地黄、鸡血藤、乳香、狗脊、薏苡仁、乌梢蛇、骨碎补、黄芪、牡蛎、鹿角霜、伸筋草、龙骨1、五灵脂、延胡索、地龙、冰片、当归、蜈蚣、天麻、牛膝。木瓜蛋白酶（BS190-25g，Biosharp），L- 半胱氨酸（BS181-25g，Biosharp），速眠新Ⅱ[ 兽药字（2010）070031582，圣达动物药品有限公司]，舒泰50[（2015）外兽药证号43 号，Virbac China]，仙灵骨葆胶囊（国药准字：Z20025337，同济堂制药有限公司），ELISA 试剂盒 ：IL-1β（SP25549，Saipei Biotech Co）、IL-6（SP25495，Saipei Biotech Co）、TNF-α（SP25520，Saipei Biotech Co）。

1.3 主要仪器

动物跑步机（宇晟YS-J100），电子秤（Electronic SF-400），恒温摇床（BLabotery ZHPW-250），染色机（DIAPATH Giotto），X 射线摄像系统（苏州唯特锐医疗器械有限公司 VDR-1800），脱水机（DIAPATH Donatello），组织包埋中心 （Tissue-Tek TEL），正置光学显微镜（Nikon Eclipse E100）。

2 实验方法

2.1 分组及模型制备

20 只实验兔随机分为空白组、模型组、仙灵骨葆组和腰腿痛宁组，每组5 只。模型组、仙灵骨葆组和腰腿痛宁组进行KOA 造摸。具体操作步骤：兔子保定后，剔除左膝关节局部兔毛，碘伏消毒液和75%酒精依次进行消毒，屈曲膝关节75°，定位外膝眼为进针点，诱导剂由Papain（4%）和L-Cysteine（0.03 mol·L-1）配伍，注射量0.5 mL·kg-1。在造模第1 天、第3 天、第7 天各注射1 次。同时，每日定时强迫兔在跑步机活动，早晚各1 次，每次时长为15 min，连续驱赶14 d。造模21 d 后，出现左膝关节肿胀，屈伸障碍，X 线提示膝关节结构改变，判定为KOA 模型成功。

2.2 干预方法

按照以往实验方案进行等量换算，腰腿痛宁胶囊剂量为0.177 g·kg-1，仙灵骨葆胶囊剂量为0.099 g·kg-1。腰腿痛宁胶囊和仙灵骨葆胶囊去除胶囊外衣后，所得药粉均用10 mL 的纯净水配成溶液，每日1 次，连续灌胃28 d。空白组和模型组无需特殊处理，常规饲养即可。

2.3 标本采集

实验结束后，兔右后肢肌肉注射麻醉，麻醉剂（舒泰50 和速眠新Ⅱ，配比 6:1），0.35 mL·kg-1。关节腔内注入0.8 mL 无菌生理盐水，屈伸关节15 次，抽取膝关节液 0.5 mL，耳缘静脉处取血 5 mL，均注入无菌 EP 管中离心，设置参数为3000 r·min-1，运转10 min，吸取上清液后置于-20 ℃ 冰箱中待测。采用空气栓塞法进行安乐死，打开左膝关节腔，用咬骨钳夹取股骨远端和胫骨近端，放入4%多聚甲醛固定液中保存。

2.4 检测指标

2.4.1 兔左膝关节活动度测量 观察各组治疗前后左膝关节活动度改变情况。在治疗前（OA 模型建立后）和治疗结束后，用量角器测量兔左后肢膝关节活动角度，评估关节被动活动范围。量角器的轴心放置在膝关节的中心，量角器的静止臂与股骨平行固定，移动臂跟踪胫骨的运动。分别记录膝关节处于最大伸展和屈曲状态时的角度（°）。膝关节活动范围的计算方法是最大伸展角度减去最大屈曲角度。

2.4.2 X 线片影像 观察各组拍摄X 线片，观察膝关节情况。兔置于固定器上，用眼罩遮住双目，待到呼吸平顺，被动延展兔双后肢，保持在适度拍摄体位。正位片拍摄方法：1）兔取仰卧位，被动屈髋30°，髋外展15°，尽量伸直膝关节，保持髌骨位于正前方，放射球管距离拍摄部位110 mm；2）拍摄侧位片时取侧卧位，左后肢伸直置于前侧，右后肢被动屈髋70°、屈膝30°置于后侧，放射球管距离拍摄部位110 mm；3）设置检验参数：工作电压45 kVP，照射电流160 mA，照射量为5.02 mAs，曝光时间31 ms。

2.4.3 软骨组织病理观察 所有实验兔左侧胫骨关节面处进行软骨取材，用锋利骨凿凿至深达软骨下骨层，软骨获取后需要修剪成大小合适组织块，放入4%多聚甲醛固定液中保存。经过脱水脱钙等一系列处理后，用光学显微镜对软骨组织情况观察拍照。

2.4.4 软骨损伤程度评价 采用Mankin 评分标准判定软骨的损伤程度。

2.4.5 血清和关节液中炎症因子水平测定 采用ELISA 法测定血清和关节液中 IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，具体检测操作方法严格按照ELISA 试剂盒说明书上进行。

2.5 统计学方法

应用GraphPad Prism 9.00 对数据进行处理，用One-Way ANOVA 检验方差齐性的数据，采用配对t检验法进行组内比较，LSD-t 法进行组间比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组左膝关节活动度变化比较

见表1。

表1 各组左膝关节活动度变化比较（±s，n = 5） °

表1 各组左膝关节活动度变化比较（±s，n = 5） °

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与治疗前比较，▲P ＜0.05

组别治疗前治疗后空白组138.40±1.67140.00±3.00模型组 91.40±3.85#100.80±4.38腰腿痛宁组 88.20±5.67#128.40±6.39△▲仙灵骨葆组 90.00±7.52#130.20±4.32△▲

3.2 各组左膝关节X线影像学比较

各组X 线片结果显示，空白组兔膝关节双侧髁间隙距离等宽，胫骨平台轮廓清晰，未见骨赘；模型组外侧髁间隙明显变窄，胫骨平台关节面粗糙不平，可见髁间隆起变锐，软骨下骨骨质硬化，骨赘形成；仙灵骨葆组外侧髁间隙窄于内侧，髁间隆起变锐，骨赘形成；腰腿痛宁组关节间隙未见明显异常，髁间隆起稍变锐，骨赘形成。见图1。

图1 各组左膝关节X线影像学比较

3.3 各组病理组织HE 染色结果

HE 结果显示，空白组软骨组织染色均匀，表面光滑，细胞形态结构正常、排列规则，潮线完整；与空白组比较，模型组软骨组织显示局部软骨细胞排列不规则，有多处裂隙，出现陷窝，符合骨关节炎病理改变，提示造模成功；仙灵骨葆组关节软骨中可见裂隙，软骨欠光泽，关节面稍不平整，但情况好于模型组；腰腿痛宁组显示关节软骨中可见少量裂隙，关节表面较光滑平整，结构改善。见图2。

图2 各组病理组织HE 染色结果

3.4 各组治疗后左膝关节软骨Mankin 评分比较

见表2。

表2 各组治疗后左膝关节软骨Mankin 评分比较（±s，n = 5） 分

表2 各组治疗后左膝关节软骨Mankin 评分比较（±s，n = 5） 分

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别评分空白组0.00±0.00模型组5.00±0.71#腰腿痛宁组2.20±0.84△仙灵骨葆组2.40±1.14△

3.5 各组治疗后血清中炎症因子水平比较

见表3、图3。

图3 各组治疗后血清中炎症因子水平比较

表3 各组治疗后血清中炎症因子水平比较（±s，n= 5）

表3 各组治疗后血清中炎症因子水平比较（±s，n= 5）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白组106.18±9.80 106.18±9.80410.25±43.05模型组152.75±4.03# 152.75±4.03# 674.42±38.30#腰腿痛宁组108.09±8.50△108.09±8.50△ 466.57±64.49△仙灵骨葆组108.64±4.19△108.64±4.19△ 463.47±57.85△

3.6 各组治疗后关节液中炎症因子水平比较

见表4、图4。

图4 各组治疗后关节液中炎症因子水平比较

表4 各组治疗后关节液中炎症因子水平比较（±s，n= 5）

表4 各组治疗后关节液中炎症因子水平比较（±s，n= 5）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白组 67.29±6.55 513.18±39.01113.36±24.54模型组100.63±11.29# 909.05±98.42# 179.67±13.27#腰腿痛宁组 74.02±9.44△542.71±106.08△132.60±30.20△仙灵骨葆组 76.62±9.75△542.02±99.51△ 124.46±28.15△

4 讨论

骨关节炎与肾气亏损致血瘀痹阻有关，患者伴有膝部疼痛，关节屈伸不利，甚则僵硬。本人经过数十载的临床经验总结出了“益肾填精、活血除痹”的独特诊治思路，研制出腰腿痛宁胶囊。此方药具有益肾填精之效，可濡养骨骼强健经筋。方中选用鹿角霜，取其补肾阳亦强筋骨之用，在配伍熟地黄滋阴，益精填髓，二者同用平调阴阳，壮其筋骨。骨碎补能活瘀血，续断伤，传统中医药在治疗骨折疾病时大量应用，有破血止血，补伤折之说。当归可活血、亦补血；狗脊强筋骨，能止痛；黄芪补气血，驱病邪。地龙，乌蛇，蜈蚣配伍，增强活血通络之功，气血聚处，祛邪以无痕。诸药共用，周流气血，通畅经脉，其病可愈。仙灵骨葆胶囊在诊疗指南（2020年版）[9]中为膝关节炎推荐用药，临床证实能有效改善膝骨性关节炎患者的各项指标[10]。将其作为阳性对照组药物，能与腰腿痛宁胶囊组形成良好对照。

团队前期实践证明腰腿痛宁胶囊在治疗 KOA 临床疗效显著[11]，此次研究设计动物实验主要探讨其作用机制。木瓜蛋白酶能直接作用于兔关节软骨，引起细胞外基质中蛋白多糖的降解[12]。蛋白多糖的缺失会相对增加胶原蛋白的暴露，促炎因子和基质金属蛋白酶对基质的破坏也会加强，导致软骨基质的大量流失[13]。然而，软骨细胞新分泌的胶原蛋白等基质成分的性能较差，软骨基质的生物和机械性能发生变化，软骨失去正常的弹性和抗压能力，最终导致骨关节退化[14]。这种方法可以避免手术引起的关节腔内出血、结构破坏等并发症的干扰，适用于研究软骨的病理变化和药物对早期KOA 的治疗效果。兔造摸后，左下肢均出现不同程度肿胀，皮温升高情况。驱使兔被迫运动，可见兔左后肢因疼痛无法触及地面，出现跛行。同时，抽取患肢关节液时，呈浑浊状态，以上改变与早期KOA 病理发展基本一致，说明兔KOA 模型建立成功。

研究[15]发现，软骨组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的增加是骨关节炎的主要特征，炎症在骨关节炎的发生发展中起核心作用。在骨关节炎的早期阶段，分解代谢活性增加，这与炎症介质、软骨降解蛋白和应激反应因子的表达增加有关[16]。这些改变导致软骨细胞丢失，从浅层的纤颤到更复杂和更深的裂隙[17]。IL-6 可以促进成纤维细胞的产生，并通过增强KOA 中IL-1β 和TNF-α 等细胞因子的破坏作用而加速软骨基质的降解[18-19]。同时，TNF-α也可诱导 IL-1、IL-6 等的释放，它们之间相互影响，共同作用于骨关节炎发生、发展的各个环节[20]。给药28 d 后，药物治疗组胫骨软骨表面粗糙度减弱，软骨细胞排列更加整齐，同时血清和关节液中的炎症因子明显减少。驱赶兔被迫运动时，治疗组后肢蹬地有力，而模型组仍有不同程度跛行。实验中兔关节损伤程度基本与炎症因子水平呈正相关，说明通过抑制血清和关节液中1L-1β、IL-6、TNF-α 水平可以延缓KOA 病情发展。

本研究结果显示，经腰腿痛宁胶囊干预后，兔早期KOA 模型血清和关节液中1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平均明显降低。说明腰腿痛宁胶囊能延缓软骨的退化，其作用机制可能与降低炎症因子水平有关。由于腰腿痛宁胶囊是中药复方制剂，且KOA 发病机制复杂，所以其药物有效成分和作用靶点需进一步深入研究。