江 川,黄玉芳,卓 实,章 靓
(福建中医药大学附属人民医院药学部,福州 350004)
丹瓜护脉颗粒是福建中医药大学附属人民医院在特色中药制剂丹瓜护脉口服液的基础上研制的,由丹参、赤芍、瓜蒌、川芎等八味中药组成,具有调节糖脂代谢,抗氧化应激,改善血管功能的作用[1-4],临床研究证明丹瓜护脉制剂对糖尿病血管病变具有显著疗效[5-6],方中丹参活血祛瘀为君药,赤芍活血散血为臣药,助君药活血祛瘀。经查阅文献[7],并按照前期预实验的研究[8],本研究采用高效液相色谱法(HPLC)法检测丹瓜护脉口服液和颗粒剂中的丹酚酸B 与芍药苷2 种成分,并同时进行抗糖尿病药效学实验,为丹瓜护脉制剂新剂型研制提供科学数据。
HP-1100 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司,DAD 二极管阵列检测器),LE104E 240 电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司),超声波发生器(上海精密仪器仪表有限公司),随手测血糖仪[强生(中国)医疗器材有限公司],电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
丹瓜护脉颗粒由福建中医药大学附属人民医院药剂科制剂室制备,批号分别为20210903、20211001、20211002;丹瓜护脉口服液由本院药剂科制剂室制备,批号分别为20210601、20210602 和20210603。芍药苷对照品(批号:110736-200424)、丹酚酸B对照品(批号:180208)均购于北京中科质检生物技术有限公司,含量≥98%;川芎对照药材(批号:200204)购于北京中科质检生物技术有限公司;肾上腺素(批号:M08GS147766,购于上海源叶生物科技有限公司);乙腈(批号:A104441,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、甲醇(批号:P109359,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)均为色谱级;超纯水自制。
选取SPF 级KM 小鼠,雄性,20 ~22 g,购自北京华埠康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0008,合格证号:110322210102917173。选取SPF 级C57BL/6 小鼠,雄性,18 ~20 g,购自杭州医学院,许可证号:SCXK(浙)2019-0002,合格证号:20211117Abzz0100000103;实验动物饲养于福建省中医药研究科学院动物房,室内温度为25℃,湿度为75%,饲养1 周后使用。本研究已通过伦理委员会审批(动物伦理号:2021068)
取川芎5 g,粉碎,取粉末加乙醚 30 mL,加热回流提取60 min,过滤,将滤液挥干,加2 mL 乙酸乙酯,溶解残渣,作为供试品溶液。取川芎对照药材0.5 g,按前述方法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法(中国药典2020 年版)试验,吸取上述两种溶液各 2 μL,点于硅胶G 薄层板上,用正己烷-乙酸乙酯(9:1)为展开剂,展开,取出,晾干后置于紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。见图1。
图1 川芎薄层色谱图
按2020 年版《中国药典(四部)》颗粒剂项下规定,对三批样品的粒度、水分、溶化性、干燥失重、重金属、砷盐进行检查,结果 三批样品的检查结果均符合《2020 年版药典》颗粒剂项下标准。结果见表1。
表1 三批样品检查结果
2.3.1 色谱条件 色谱柱:Ultimate C18(4.6 mm×250 mm,5 µm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(17:83);流速:1 mL·min-1;检测波长:230 nm;柱温:室温;进样量:20 µL。
2.3.2 试液配制 取实验所需的芍药苷和丹酚酸B对照品,配制的对照品含量:芍药苷为21.8 µg·mL-1、丹酚酸B 为22.4 µg·mL-1。精密称取 1 g 的丹瓜护脉颗粒样品通过乙酸乙酯定容至1 mL,超声提取后,摇匀,过滤,取续滤液配制供试品溶液。
2.3.3 方法学考察 1)专属性试验:上述色谱条件下,色谱图中两种对照品相邻峰分离度均>1.5;理论塔板数均>1 万。色谱图见图2。2)线性关系考察:以对照品色谱峰面积(A)为纵坐标,对照品浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,芍药苷回归方程为Y= 50.268 6X+ 25.226 4(r= 0.999 9),线性范围为3.3 ~95 µg·mL-1;丹酚酸B 的回归方程为Y= 57.946 4X+ 33.184 1(r= 0.999 9),线性范围为2.5 ~80 µg·mL-1。3)精密度试验:取芍药苷和丹酚酸B 的混合对照样品溶液,每次20 μL,连续进样6 次,计算结果芍药苷RSD为2.32%和丹酚酸B 的RSD为2.66%,说明色谱仪精密度良好。4)重复性试验:取丹瓜护脉颗粒样品(批号20211001)按设定方法提取和液相分析,计算芍药苷和丹酚酸B 的RSD分别为2.41%、2.19%,说明该方法的重复性良好。5)加样回收试验:取丹瓜护脉颗粒样品(批号20211001)按设定方法提取和液相分析,结果芍药苷和丹酚酸B 含量的平均回收率与RSD值分别为97.63%(1.33%)、95.00%(2.43%)。结果见表2。
图2 专属性试验粒HPLC 色谱图
表2 样品芍药苷、丹酚酸B 含量测定结果
2.3.4 样品测定 批号为20210903、20211001、20211002 丹瓜护脉颗粒样品中分别取出1 g,按上述颗粒剂溶液样品的方法制备其对应的试验溶液,按照上述实验相同的色谱条件进样测定,通过外标法计算芍药苷、丹酚酸B 含量,三批丹瓜护脉颗粒中芍药苷的含量均>1.3 mg·g-1,丹酚酸B 含量均>0.8 mg·g-1。结合实际生产工艺波动,暂拟定丹瓜护脉颗粒制剂质量标准芍药苷含量不得少于1.0 mg·g-1,丹酚酸B 含量不得少于0.6 mg·g-1。见表3。
表3 样品芍药苷、丹酚酸B 含量测定结果 mg·g-1
2.4.1 对肾上腺素高血糖小鼠的降血糖作用 将购回的小鼠喂养3 d 后,随机分成6 组,即丹瓜护脉颗粒高、中、低剂量组( 40 g·kg-1、20 g·kg-1、10 g·kg-1);丹瓜护脉口服液组(20 mL·kg-1);空白对照组(等剂量蒸馏水);阳性对照组(二甲双胍0.2 g·kg-1)。按照组别连续3 周,每天1 次进行灌胃给药,最后1次给药前的0.5 d内不禁水但禁食,给药后继续禁食2 h 后测定其空腹血糖,随即腹腔注射0.4 mg·kg-1的肾上腺素,0.5 h 后测定其血糖。
丹瓜护脉颗粒对肾上腺素高血糖小鼠的降血糖实验结果见表4,肾上腺素造模后,给药组与空白对照组比较,小鼠血糖明显下降,具有显著性差异。
表4 丹瓜护脉颗粒对肾上腺素高血糖小鼠的降血糖实验结果(±s,n = 10) mmol·L-1
表4 丹瓜护脉颗粒对肾上腺素高血糖小鼠的降血糖实验结果(±s,n = 10) mmol·L-1
注:与空白组比较,# P <0.05,## P <0.01
组别给药前血糖浓度给药0.5 h 后血糖浓度颗粒剂高剂量8.610±0.97615.910±2.589#颗粒剂中剂量8.720±0.58716.200±2.338#颗粒剂低剂量7.080±0.88816.440±2.365#口服液组8.060±1.11314.990±2.561##空白组7.930±0.52519.720±3.895阳性组7.756±0.67810.711±2.798##
2.4.2 对链脲佐菌素(STZ)高血糖小鼠的降血糖实验
2.4.2.1 正常动物降糖实验 选健康成年小鼠按禁食3 ~5 h 的血糖水平分组后,随机其分为口服液组(20 mL·kg-1)、空白对照组(蒸馏水)和颗粒剂(40 g·kg-1)组。其中口服液组与颗粒剂组分别通过灌胃给高剂量的口服液和颗粒剂,灌胃给药持续30 d 后测量其空腹血糖值,并分别与空白组比较其血糖浓度差异。丹瓜护脉颗粒与丹瓜护脉口服液对正常小鼠灌胃30 d 血糖变化见表5,丹瓜护脉颗粒剂组血糖明显升高。
表5 丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对正常小鼠灌胃30 d后的血糖影响(±s,n = 10) mmol·L-1
表5 丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对正常小鼠灌胃30 d后的血糖影响(±s,n = 10) mmol·L-1
注:与空白组比较,## P <0.01
组别30 d 后血糖浓度颗粒剂组8.870±0.882##口服液组8.060±1.113空白组9.730±0.525
2.4.2.2 高血糖模型动物降糖实验 购入小鼠喂养3 d 后,随机取15 只小鼠不禁水但禁食4 h,随后测量空腹血糖,将此数值作为该批小鼠的基础血糖值。再将此批小鼠禁食24 h 但不禁水,持续5 d 通过腹腔注射以50 mg·kg-1为体质量剂量的STZ 造以糖尿病小鼠模型。第10 天时测空腹血糖,小鼠血糖值在10 ~25 mmol·L-1则说明造模成功,符合糖尿病模型要求。糖尿病模型小鼠按血糖水平随机分为丹瓜护脉颗粒高、中、低剂量组(40 g·kg-1、20 g·kg-1、10 g·kg-1);丹瓜护脉口服液高、中、低剂量组(20 mL·kg-1、10 mL·kg-1、5 mL·kg-1);空白对照组(等剂量蒸馏水);阳性对照组(二甲双胍0.2 g·kg-1);组间差≤1.1 mmol·L-1。连续灌胃30 d。第30 天时禁食4 h,随后测量其空腹血糖值并相互比较。丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对高血糖模型小鼠的血糖影响见表6。持续灌胃30 d 后血糖浓度稳定,与空白组比较血糖浓度明显下降。
表6 丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对高血糖模型小鼠的血糖影响(±s,n = 10) mmol·L-1
表6 丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对高血糖模型小鼠的血糖影响(±s,n = 10) mmol·L-1
注:治疗前,与空白组比较,# P <0.05;治疗后,与空白组比较,△P <0.05,△△P <0.01
组别造模成功后测得血糖灌胃30 d 后测得血糖颗粒剂高剂量组19.090±5.29419.189±4.334△△颗粒剂中剂量组20.060±6.20920.530±4.172△颗粒剂低剂量组19.200±4.49520.720±4.734△口服液高剂量组20.090±4.33518.790±3.099△△口服液中剂量组19.540±4.80319.900±4.512△口服液低剂量组19.470±4.96921.200±6.483空白组19.890±5.66025.360±4.595阳性组20.190±5.51117.940±4.885△△正常组 8.560±0.669# 8.330±0.291△△
2.4.2.3 高血糖模型动物糖耐量实验 各组禁食4 h后立即测量其血糖浓度,测量完毕后立刻向上述各组(颗粒剂高剂量组、中剂量组、低剂量组)给药或对应体积的溶剂(蒸馏水)。给药完成20 min 之后,通过腹腔以2.0 g·kg-1为体质量剂量进行葡萄糖注射。注射后分别于0.5 h 和2 h 后测定各组的血糖浓度,并根据计算其葡萄糖曲线下面积(AUC)。实验后分别将给药组的0 h、0.5 h、2 h 时刻的血糖浓度以及AUC 值与空白对照组进行对比,观察其变化。丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对高血糖模型小鼠的糖耐量影响见表7。与空白组相比,不同浓度的丹瓜护脉口服液和丹瓜护脉颗粒剂对小鼠血糖曲线下面积明显下降,具有显著性差异。
表7 丹瓜护脉颗粒和丹瓜护脉口服液对高血糖模型小鼠的糖耐量影响(±s,n= 10)
注:与空白组比较,# P <0.05,## P <0.01
组别0 h 血糖浓度/(mmol·L-1) 0.5 h 血糖浓度/(mmol·L-1) 2 h 血糖浓度/(mmol·L-1) 血糖曲线下面积颗粒剂高剂量组19.19±4.33##34.56±12.3820.82±4.18##59.09±8.52##颗粒剂中剂量组20.53±4.17#39.96±3.9822.52±4.21#62.23±7.31#颗粒剂低剂量组20.72±4.73#41.52±4.9621.70±4.77#62.98±7.54#口服液高剂量组18.79±3.10##37.92±5.58#20.51±4.35##58.00±3.53##口服液中剂量组19.90±4.51#38.13±5.9822.67±4.69#60.11±8.96#口服液低剂量组21.20±6.4840.20±6.0122.83±5.9862.63±9.30#空白组25.36±4.6044.52±7.4526.97±3.0271.84±8.55阳性组17.94±4.89##32.76±8.12##14.51±4.14##48.13±10.91##
由表4 和表7 可知,与空白对照组比较,颗粒剂组和传统口服液剂组均可显著降低小鼠的血糖值,表明该方药效良好;颗粒剂组药效与传统口服液剂组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,丹瓜护脉口服液改变原剂型制成颗粒剂方案科学、合理、可行。
在流动相的选择中,本实验先用甲醇和0.1%磷酸溶液作为液相流动相,发觉丹酚酸B 的分离不理想,然后加入甲醇,峰形发生变化,便把甲醇改为乙腈,发现芍药苷和丹酚酸B 在图上峰型较好,故对乙腈和0.1%磷酸溶液的流动相浓度进行调节,乙腈-0.1% 磷酸为17:83 峰型较好,分离度较好,因此本实验选择了17:83 的乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。
持续的高血糖模型实验的造模常常采用链脲佐菌素进行造模[9-10],这是一种广谱抗生素,但由于其对胰岛β 细胞具有高度的选择性且对胰岛β 细胞具有一定毒性,故导致机体出现糖尿病症状,其病理机制为使胰岛β 细胞坏死,使机体出现胰岛素依赖性糖尿病;肾上腺素是一种交感神经兴奋药物,可以促进多条糖代谢途径以迅速提高机体血液的含糖量,使得血糖迅速升高。利用这一特点可向小鼠注射肾上腺素以形成急性高血糖模型。
本实验结果显示,对比丹瓜护脉制剂剂型在对抗由肾上腺素所引起的急性高血糖实验中,口服液组降血糖的作用强度较强,与空白组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),与阳性组对比,均存在显著差异(P<0.05)。提示低剂量的丹瓜护脉颗粒及其口服液对急性高血糖的对抗具有显著功效。
与空白组相比,使用任意一种丹瓜护脉制剂向小鼠灌胃,均可显著降低其葡萄糖的曲线下面积(P<0.05),其中高剂量口服液组与高剂量颗粒组(P<0.01),提高机体的糖耐量。但其效果远不及阳性组的二甲双胍效果(P<0.05),其中颗粒剂组不同剂量间曲线下面积差异不显著(P>0.05),结合上述实验临床使用建议使用低剂量即可,避免长时间服用导致摄入糖分较高。
综上所述,对于长期高血糖,丹瓜护脉制剂具有预防高血糖加重作用,但不如二甲双胍的降血糖功效显著,且其颗粒剂本身或存在一定含糖量;对于急性高血糖患者,其具备一定降糖功效。