黄芩治疗主动脉夹层作用机制的预测及相关mRNA-miRNA-lncRNA网络构建

刘冰清,刘丹伶奕,沙梦瑶,万 红,夏 薇,刘 畅

(北华大学医学技术学院,吉林 吉林 132013)

主动脉夹层(Aortic dissection,AD)是指由于主动脉内膜破裂导致血管内的血液进入动脉壁形成假腔而引发的一种心血管疾病[1].美国的一项研究[2]表明,2012—2019年,AD的死亡率有所增加,且以女性居多.探究AD的调控机制,寻找新的有效药物,对AD的治疗具有重要意义.

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA[3],定位于细胞质的lncRNA主要影响mRNA的稳定性,也可作为竞争性内源RNA(ceRNA)[4],通过miRNA的特异性海绵吸附能够间接降低miRNA与下游靶基因结合,从而参与基因调控[5].近年来研究[6]发现,长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)在AD的病程进展中发挥着重要的调控作用.LncRNA H19通过miR-193b-3p调节平滑肌细胞功能,并参与了AD血管重塑.SONG Y等[7]研究证实,LncRNA SENCR/miR-206轴可以参与调节VSMC的增殖、迁移和表型转换,从而减缓AD的进展.因此,在AD的病理及分子机制的研究中,由mRNA、miRNA和lncRNA组成的转录网络越来越引起重视.

中药具有多成分、多靶点的特点,中药的活性成分在心血管疾病中对miRNA和lncRNA亦具有一定调控作用[8].因此,探索中药成分治疗AD的mRNA-miRNA-lncRNA网络研究及其调控作用具有一定的研究价值.黄芩(Scutellariabaicalensis,SB)为唇形科植物[9],在中国、韩国和日本被广泛用作膳食成分和传统药材,具有抗炎、抗癌、抗过敏和抵御病毒作用[10].黄芩中含有的主要活性成分已在心血管疾病中得到广泛应用,黄芩的活性成分三羟基黄酮可以通过抑制腹主动脉壁内活性氧的产生,减少炎性细胞浸润,能够降低基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)活性,从而有效地减少血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的小鼠腹主动脉瘤的形成[11].LIU H等[12]的研究表明:黄芩中的一种类黄醇成分——黄芩素可通过激活血管平滑肌细胞中MLCK/p-MLC通路,有效调节自发性高血压大鼠的血压,然而目前SB对AD的具体作用及机制尚不明确.

中药的活性成分能够在心血管疾病不同病理机制中发挥协同作用.丹参酮IIA是丹参的中药活性成分之一,可能通过抑制miR-1的表达减少心律失常和心源性猝死的发生.还有研究[10]表明,丹参酮IIA可通过上调miR-133、抑制半胱氨酸酶-9改善心肌细胞的凋亡.淫羊藿苷是传统中药淫羊藿的主要活性成分之一,LncRNA H19- PKCβⅠ轴是淫羊藿苷抑制动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的重要调控通路[8].基于以上研究发现,中药的活性成分在治疗心血管疾病中对miRNA和lncRNA具有一定调控作用.因此,可以探索中药成分治疗AD中的mRNA-miRNA-lncRNA 网络构建.

本研究旨在利用生物学信息的方法挖掘黄芩治疗AD的活性成分-靶点网络,并构建mRNA-miRNA-lncRNA三元转录网络,以期阐明黄芩多途径、多组分、多靶点协同作用的分子机制,并为后续基础和临床实验研究提供依据.

1 资料与方法

1.1 黄芩活性成分筛选和靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http:∥tcmspw.com/tcmsp.php)获取黄芩的有效成分.根据药物的药代动力学特征,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥ 0.18 为条件进行活性成分及潜在靶点筛选[13],运用 UniProt 数据库(http:∥www.uniprot.org)获取目标基因官方名称.

1.2 主动脉夹层疾病相关差异表达基因挖掘

AD基因表达谱原始数据(GSE52093,基因芯片平台:GPL10558)来源于基因表达综合数据库 GEO(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).该数据的人体组织样本包含斯坦福急性 A 型主动脉夹层患者(n=7)和正常对照组(n=5).通过GEO2R分析(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/),以 log2(FC)的绝对值>1.0 和P<0.05 为筛选条件进行基因数据挖掘,得出差异表达基因.

1.3 活性成分-靶点网络及 mRNA-miRNA-lncRNA 转录网络构建

取AD疾病相关差异表达基因与黄芩预测靶点的交集,得到黄芩治疗AD可能涉及的活性成分及关键mRNAs.通过miRTarBase(http:∥mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)和StarBase v2.0(https:∥starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php)数据库筛选与mRNAs结合的miRNAs,将获取的miRNAs通过Mircode 数据库(http:∥www.mircode.org/)进行映射,最终得到miRNAs调控的lncRNAs.运用 Cytoscape 3.8.0 软件构建活性成分-靶点网络及mRNA-miRNA-lncRNA三元转录网络.将上述关键 mRNAs 输入 STRING 数据库(https:∥string-db.org/),并将物种设定为“homo sapiens”,最低互作得分设置为 0.4,得到蛋白相互作用网络.

1.4 靶点功能富集分析

mRNA的基因名称通过R语言“org.Hs.eg.db”转换为基因ID,基因本体(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)的差异表达基因(DEGs)分析由R语言“cluster Profiler”进行,以了解其生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF).

1.5 分子对接技术与可视化

从TCMSP获得黄芩主要活性成分的三维结构作为配体,用PyMOL软件(https:∥www.pymol.org)将黄芩主要活性化合物的3D结构保存为mol2文件,并使其能量最小化.将从PDB数据库(https:∥www.rcsb.org/)获得关键靶点的三维结构作为受体,利用Auto Dock Tools 1.5.6软件将化合物及靶蛋白格式转换为.pdbqt格式,最后进行分子对接,对接结果运用PyMOL 软件进行可视化处理.

2 结 果

2.1 黄芩活性成分及靶点

通过TCMAP数据库获得黄芩活性成分得到SB有效成分有32个,共检索到507个靶点.使用Uniprot数据库将作用靶点转为基因名称,删除无效与重复靶基因,共得到SB有效成分作用靶点123个.见表1.

表1 黄芩主要活性成分Tab.1 Main active ingredient of Scutellaria baicalensis

2.2 主动脉夹层疾病靶点

基于GSE52093的测序数据共筛选差异表达基因1558个(见图1 a),且AD组和对照组基因分布有明显差异(见图1 b).将数据集GSE52093筛选出的差异基因与黄芩的靶基因取交集得到23个靶基因:IL6、HIF1A、PTGS2、ESR1、CXCL8、PGR、CDKN1A、MAPK14、FN1、PLAU、CCL2、CCNB1、FOSL1、BAX、CHEK1、PTGS1、FASN、NR3C2、F10、KCNMA1、ADRA1B、MAOB和MAP2(见图1 c).

图1 AD患者GEO基因芯片的差异表达基因Fig.1 Differentially expressed genes in GEO microarray of AD patients

2.3 活性成分-靶点网络

构建黄芩治疗AD的活性成分-靶点网络(见图2),其中活性成分汉黄芩素(wogonin,MOL000173)、β-谷甾醇(beta-sitosterol,MOL000358)、黄芩素(baicalein,MOL002714)和豆甾醇(stigmasterol,MOL000449)的节点度较高(见表2).

图2 黄芩活性成分-靶点网络Fig.2 Active ingredient-target network of Scutellaria baicalensis

表2 黄芩AD前10 候选活性成分及节点度

2.4 mRNA-miRNA-lncRNA转录网络

将取交集获得的23个差异表达基因分别输入miRTarBase和StarBase v2.0数据库,为保证其可靠性,取2个数据库的同时对mRNA-miRNA调控关系进行探索,结果得到17个差异mRNAs可靶向到miRNA,即得到AD的17个差异mRNAs和27个差异miRNAs,共34个mRNA-miRNA调控关系.通过Mircode数据库将得到的miRNA 靶向lncRNA,得到 340个lncRNA,共2574个 miRNA-lncRNA 调控关系,最终形成mRNA-miRNA-lncRNA 三元转录网络(图3 a),其中同时具备三者转录关系的RNA包括11个mRNA、27个miRNA和340个lncRNA.网络中节点度排名较高的lncRNAs TPTEP1、CROCCP2,miRNAs hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-761和hsa-miR-3619-5p可能在网络中起关键作用.借助STRING 数据库绘制核心靶点 PPI 网络包括23个节点和81条边,共19个基因在PPI网络中互作密切(图3 b).在潜在靶基因中,IL6、PTGS2和HIF1A节点度相对较高,可能是核心作用基因(图3 c).

红色.mRNA;绿色.miRNA;紫色.lncRNA.a.黄芩治疗AD的mRNA-miRNA-lncRNA 转录网络;b、c.黄芩治疗AD的PPI网络及核心作用基因.图3 黄芩治疗AD的mRNA-miRNA-lncRNA转录网络、PPI网络及核心作用基因Fig.3 mRNA-miRNA-lncRNA transcription network,PPI network and core genes in the treatment of AD by Scutellaria baicalensis

2.5 关键靶点GO和KEGG富集分析

将23个SB作用于AD的潜在靶点进行GO和KEGG富集分析及可视化,其中生物过程(Biological Process,BP)主要涉及细胞增殖调控过程和生物过程相关的正向调控等;细胞组分(Cellular Component,CC)主要涉及在细胞膜的封闭腔、细胞器外膜和内质网等;分子功能(Molecular Function,MF)主要涉及抗氧化活性、转录调节活性和信号传感器活性调节等.KEGG富集分析结果显示23个靶点主要在159条信号通路上富集,主要涉及IL-17信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路和核苷酸结合寡聚域受体(NOD)样受体信号通路(见图4、表3).

图4 潜在靶点的GO和KEGG富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of potential targets

表3 KEGG富集主要通路及其靶点Tab.3 The main pathway and its target in KEGG enrichment

2.6 分子对接

将黄芩治疗AD节点度值排名较高的汉黄芩素、β-谷甾醇、黄芩素和豆甾醇4个活性成分(见表2)、KEGG信号通路中占比最高的标志蛋白MAPK14(PBD ID:2fst)(见图5)和PPI核心网络中排名最高的标志蛋白IL6(PBD ID:1alu)进行分子对接(见图3).当结合能≤-5 kJ/mol时,受体与配体可以达到较好的结合[14].结果显示,各活性成分均能与IL6和MAPK14很好结合,其中豆甾醇虽与2个靶点的亲和力最高,但其可结合氢键较少(见表4).而黄芩素(baicalein,MOL002714)与IL6、MAPK14的可结合氢键较多,且通过查阅相关文献可知,黄芩素(三羟基黄酮)已在腹主动脉瘤中被证实可起到预防和治疗的作用[11],因此,选择黄芩素与2个靶点基因进行分子对接可视化(见图6).

图5 KEGG通路中的基因靶点Fig.5 Gene targets in KEGG pathway

表4 黄芩中主要活性成分分子对接结合能Tab.4 Molecular docking binding energy of main active components in Scutellaria baicalensis

图6 黄芩素与核心靶点分子对接模式Fig.6 Molecular docking pattern between Scutellaria baicalensis and core target

3 讨 论

AD是一种自发性的心血管疾病,类似于“雪崩”的发生,AD的诱因常常呈隐匿性,血管壁病变常累积到一定阈值后突然引发疾病[15],且具有较高的发病率和死亡率[16].单一药物成分无法有效控制疾病的变化,中药具有多靶点、多成分的特点,能够在疾病进展的不同阶段进行干预治疗,这可能为治疗AD提供新思路.近年来,大量研究[17]表明,黄芩的主要成分可能在治疗和预防心血管疾病中起着至关重要的作用.

本研究中从32个候选活性成分中筛选出黄芩治疗AD排名较靠前的主要活性成分,包含汉黄芩和黄芩素等成分,其中汉黄芩具有一定的抗氧化特性,可通过靶向Nrf-2途径调控其下游抗氧化基因Ho-1和Nqo-1的表达,从而减轻氧化应激引起的心脏肥大[17].黄芩素通过NF-κB和p38 MAPK信号通路减轻疾病诱导的氧化应激和炎症反应,从而缓解AS.SULIST YOWATI E等[18]在体内体外研究中发现,黄芩素具有抑制平滑肌血管钙化的潜在作用.以上研究均支持本次网络预测的结果,然而还有很多活性成分尚未得到进一步的实验证实,尤其在AD中的作用机制还有待于进一步探索.

本研究基于GEO数据库中GSE52093数据集进行基因数据挖掘,筛选出黄芩治疗AD的23个靶基因并进行GO和KEGG富集分析.其中,IL6是PPI核心网络中节度值最高的靶基因,而MAPK14在信号通路基因富集结果中占比最高.IL6可在β氨基丙腈(BAPN)诱导的AD大鼠模型中表达上调,并通过增强MMP2的表达,加速血管壁细胞外基质降解,从而促进AD的形成[19].MAPK14为一种丝裂原活化蛋白激酶主要编码p38α,p38α是VSMC中p38MAPK家族的主要亚型,是诱导腹主动脉瘤(AAA)形成的上游调节因子,MAPK14(p38α)的缺失可以抑制Ang Ⅱ诱导的AAA的形成[20].GO分析结果得出,靶基因主要涉及细胞增殖调控过程、转录调节和抗氧化活性调节等.KEGG富集结果中,IL-17、p53、TNF、FoxO和NOD样受体信号通路与SB作用于AD关系最为密切.白细胞介素-17(IL-17)是一种促炎细胞因子,JUX等[21]的实验表明,Th17-IL-17通路与人主动脉瘤具有直接相关性,是AngⅡ介导血管炎症主要效应轴.肿瘤坏死因子(TNF)是免疫反应中的中枢调节因子之一,主要参与疾病的促炎反应,TNF信号通路与IL17信号通路都为血管壁破坏后主要的炎症反应通路[22].P53是一种肿瘤抑制因子[23],在细胞增殖、凋亡、细胞周期调控和DNA损伤修复中具有重要的调控作用[24].LI Y等[25]研究表明,miR-124a可参与调节Wnt/β-连环蛋白和P53途径的活性,通过靶向BRD4抑制AAA的发展.FoxO转录因子家族包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6,可以与靶基因的启动子结合调控维持细胞稳态的主要过程,如氧化应激调节、细胞增殖等[26].YANG X等[27]研究表明,Spry蛋白是酪氨酸激酶(RTK)信号传导的反馈调节剂,其中Spry1和Spry4蛋白可以通过Akt/FoxO/心肌素信号轴参与调节人VSMC分化表型.与该通路相关研究[28]还提出,菠萝蛋白酶(Br)为一种从菠萝茎中提取的蛋白水解酶,其主要可通过Akt/FOXO途径降低心肌梗死的严重程度并对缺血再灌注损伤的心脏起到保护作用.核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NLRs)是哺乳动物先天免疫系统的重要组成部分,研究[29]发现,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体与动脉粥样硬化、心衰等心血管疾病联系较为紧密.然而,FoxO和NOD样受体通路在AD中的研究进展尚不全面,有待于进一步探索.分子对接结果显示,SB治疗AD的主要成分可与以上信号通路中的相关蛋白很好地结合,进一步证明了预测的准确性,反映了中药成分可“多途径,多靶点”参与疾病分子机制的特征.

基于生物信息学技术,本研究首先筛选出了差异性mRNAs,并通过数据库预测靶向miRNA和lncRNA,其中LncRNA TPTEP1在lncRNAs组中节点值最高.研究[30]表明,LncRNA TPTEP1可通过靶向miR-761/LATS2轴抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和转移.LncRNA TPTEP1还在肝癌和急性髓系白血病中参与调控[31],而在心血管疾病中的相关研究进展尚不明确.在miRNAs组中,hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-761在转录网络中也占据重要位置,且miR-125b-5p可以通过调控MAPK14基因参与KEGG结果中居前列的IL-17、TNF、FoxO、NOD样受体等多条信号通路.LIN F等[32]在实验中提取了小鼠骨髓来源的间充质干细胞外泌体miR-125b-5p,外泌体miR-125b-5p可以抑制Map4k4基因表达,并有效地抑制了动脉粥样硬化斑块的形成.而对于miRNAs miR-76的研究显示,miR-761在AS的致病机制中的联系较为紧密.WANG C等[33]研究显示,miR-761可能通过调节mTOR-ULK1信号通路以自噬的方式抑制泡沫细胞的形成,并下调炎性因子IL-1β和IL-18的表达,从而减少AS的形成.还有研究[34]显示,XIST可通过调节miR-761/BMP9轴抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,从而抑制AS.miR-761还可通过靶向抑制mTOR途径,从而控制VSMC的过度增殖[35].AD的主要病理学特点与AS相似,病理学过程都以VSMC异常增殖、迁移、炎症因子浸润和细胞外基质降解为特征[36].因此,进一步探索转录网络中miRNAs hsa-miR-125b-5p和hsa-miR-761在AD中的调控可能有助于我们对疾病机制的认识.

本研究通过生物信息学及网络药理学整合分析了SB治疗AD的机制,初步探讨了SB治疗AD的有效成分及其潜在用靶点,提示SB的多种活性成分在AD中的协同作用.本研究成功构建了mRNA-miRNA-lncRNA转录网络,结果显示调控网络中的靶基因与细胞增殖调控过程、转录调节、炎症反应和抗氧化活性调节等过程密切相关,并可能通过IL-17、p53、TNF、FoxO和NOD样受体信号通路发挥作用.通过miRTarBase、StarBase v2.0和Mircode数据库靶向预测得出,lncRNAs TPTEP1、CROCCP2、miRNAs hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-761和hsa-miR-3619-5p可能在mRNA-miRNA-lncRNA网络中起关键作用.最后,通过分子对接技术验证了SB的主要活性成分与疾病靶基因结合的紧密程度,可为后续实验提供依据和方向.