儿童传染性单核细胞增多症EB病毒载量及外周血T淋巴细胞亚群分布与肝损伤的相关性

王志银,王世岩,刘京硕,宋琛,张海光

(新乡医学院第一附属医院 a.检验科;b.妇产科,河南 卫辉 453100)

传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM)是由EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染后引发的常见血液系统疾病类型,儿童和青少年由于免疫系统发育不完全是EBV感染的高危人群[1-2]。EBV感染B淋巴细胞后可在一定条件下激活并释放EBV病毒颗粒,进而激发机体免疫应答,人体免疫系统在杀伤病毒的同时对机体造成免疫破坏,是IM发病的主要原因和机制[3-4]。IM的症状多表现为发热、淋巴结炎症等,多数预后良好,但也有少数患儿会合并急性或慢性并发症,如肝损伤、肾损伤、严重扁桃体增大伴气道阻塞等,其中肝损伤是较为常见的类型。相关研究提示,EBV感染后免疫破坏的程度可能与并发肝损伤及预后具有一定相关性,但尚未有明确结论[5]。基于此,本研究拟通过检测IM患儿外周血T淋巴细胞亚群及肝脏损伤标志物水平,分析IM患儿EBV感染后的病毒载量及免疫状态与肝脏损伤程度的相关性,从而为临床预后评估提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象40例IM患儿来自2021年1月至2022年12月在新乡医学院第一附属医院儿科就诊的患儿(IM组),其中男25例,女15例;年龄11～131个月,平均(56.4±30.3)个月。入组标准[6]:(1)有发热、咽峡炎、颈部淋巴结或肝脾大等典型的临床特征;(2)抗EBV衣壳抗原IgM和IgG抗体阳性等;(3)外周血淋巴细胞绝对值>5.0×109L-1和异型淋巴细胞比率≥10%;(4)首次确诊,且年龄≤14岁;(5)未接受系统性治疗。排除标准:(1)有除EBV以外的其他微生物感染证据;(2)合并EBV感染相关的嗜血细胞综合征、淋巴瘤等血液系统疾病及重大的免疫缺陷性疾病;(3)长期服用糖皮质激素或免疫抑制剂等药物;(4)有既往EBV感染史。另随机选择同期来院体检的40例健康儿童为对照组,其中男25例,女15例,年龄19～132个月,平均(62.5±29.8)个月。两组儿童在性别及年龄上比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经受试者监护人同意及新乡医学院第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集采集每位IM患儿及健康儿晨起空腹外周静脉血10 mL,其中乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝3管,每管2 mL,分别用于血常规、T淋巴细胞亚群及EBV核酸定量检测;普通促凝管4 mL,用于肝功能指标谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的检测。

1.3 主要试剂和仪器流式细胞仪(DxFlex型)、流式荧光单抗试剂CD4-FITC、CD8-PE、CD3-ECD、CD45-PC7、单克隆同型对照IgG1-FITC/PE/ECD/PC7、自动生化分析仪(AU-5800型)、ALT、AST检测试剂盒均为美国贝克曼库尔特有限公司生产;EBV核酸检测试剂盒及Smart全自动核酸提取仪(广州达安基因股份有限公司);Mx3000荧光定量PCR仪(上海伯乐生命医学产品有限公司); XN-2000型全自动血细胞分析仪及血常规检测相关试剂(希森美康医用电子有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群 取流式专用试管2支,分别标记为A管、B管,A管中加入CD45-PC7、CD4-FITC、CD8-PE、CD3-ECD各20 μL,然后加入充分混匀后的抗凝全血100 μL,震荡混匀,室温孵育15 min,加入溶血素500 μL,震荡混匀,孵育10 min,加入2 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS),200g离心5 min,弃上清,加入500 μL PBS重悬;B管使用单克隆同型对照抗体重复上述步骤,样本制备完成后,流式细胞仪上机检测。

1.4.2测定EBV核酸定量 血液样品处理后提取DNA,使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)-荧光探针法进行EBV DNA定量分析,操作按照试剂盒说明书进行:将提取出的DNA加入到预混的反应体系中,再进行扩增。扩增条件为:93 ℃ 2 min,93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,共10个循环;93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,共30个循环;而后25 ℃ 10 s冷却。反应结束后,依据标准曲线仪器自动读取EBV拷贝数并显示结果。

1.4.3白细胞及肝功能指标检测 采用全自动血细胞分析仪检测两组儿童的白细胞计数并分类:白细胞计数(white blood cells count,WBC)、中性粒细胞百分比(Net%)、淋巴细胞百分比(LYM%)及单核细胞百分比(Mon%),采用全自动生化分析仪检测肝功能指标ALT及AST。

2 结果

2.1 IM组与对照组儿童白细胞分类计数比较IM组患儿WBC、LYM%高于对照组,Net%低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);两组间Mon%差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 IM组与对照组白细胞分类计数比较

2.2 IM组与对照组儿童T淋巴细胞亚群的比较IM组患儿外周血CD3+、CD3+CD8+T淋巴细胞比率均高于对照组,CD3+CD4+T淋巴细胞比率及CD4+/CD8+的比值均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 IM组与对照组T淋巴细胞亚群分布比较

2.3 IM组与对照组儿童肝损伤标志物比较IM组患儿的肝功能标志物ALT、AST水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 IM组与对照组肝损伤标志物比较

2.4 IM组患儿病毒载量与肝脏损伤标志物的相关性IM组患儿EBV DNA载量水平为(70.95±1.03)×103copies·mL-1,对照组儿童EBV DNA载量水平低于最低检测值(0.5×103copies·mL-1)。Pearson相关性分析结果显示,IM组患儿的EBV DNA载量水平与ALT和AST水平均呈正相关(P<0.05)。

2.5 IM患儿T淋巴细胞亚群与肝损伤标志物的相关性Pearson相关性分析结果显示,CD3+T细胞比率与ALT及AST水平均呈正相关(P<0.05),CD3+CD4+T细胞比率与AST呈正相关(P<0.05)。CD3+CD4+T细胞比率与ALT、CD3+CD8+T细胞比率及CD4+/CD8+比值与ALT、AST间均未发现相关性(P>0.05)。

3 讨论

儿童及青少年由于免疫系统发育不完善,免疫功能较弱,易受EBV感染并引起IM的发病[7-8]。虽然IM属于自限性疾病,大部分患儿预后较好,但是由于免疫力个体差异的原因,部分患儿可出现脑膜炎、周围神经病变、肝功能损伤等并发症,对患儿造成一定损伤及后遗症[9-10]。因此,密切监测患儿病情进展并及时预防相关并发症的发生对于改善患儿预后、提高生存质量具有重要意义。ALT及AST是用于评估肝损伤的最主要标志物。EB病毒虽然为非嗜肝病毒类型,但其引起的急慢性感染依然为肝功能带来了许多不良影响[11]。本研究结果显示,与健康儿相比,IM组患儿肝功能指标ALT及AST存在一定程度的升高,提示IM患儿发生肝损伤的机率较大。通过病毒DNA载量与ALT及AST相关性的分析发现,病毒载量越高,ALT及AST水平也相对升高,提示以病毒载量为指征的病情严重程度与引起的免疫性肝脏损伤的风险呈正相关性。因此,提示临床在检验结果显示病毒载量过高时应适当给予预防性肝损伤治疗。

已有研究显示,IM患儿EB病毒感染后的免疫状态与预后及转归具有密切相关性[12-13]。T淋巴细胞亚群分布特征是机体免疫状态的重要体现,其中CD4+T细胞主要辅助B细胞产生中和抗体,当患儿EBV病毒激活后B细胞的功能受到一定影响,此时机体的免疫功能受到抑制,导致CD4+辅助性T细胞的比率降低[14]。CD8+T细胞是杀伤病毒感染B细胞的主要细胞,当EBV病毒开始复制时,免疫系统会提高CD8+T细胞比率用于抑制病毒复制[15]。因此,CD4+及CD8+细胞比率是反映机体免疫状态的指征之一,而CD4+/CD8+比值是判断人体免疫功能平衡或紊乱的敏感指标[16-17]。本研究结果显示,IM患儿外周血WBC、LYM%均高于对照组,Net%低于对照组,CD3+、CD3+CD8+T淋巴细胞水平高于对照组,CD4+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值低于对照组,提示IM患儿的细胞免疫功能处于抑制状态,与EBV感染后对免疫系统的攻击有关。有研究显示,EB感染后患儿除发热、头痛等,部分还合并表现出严重的疲劳、恶心、呕吐和纳差,体现其可能并发肝损伤或轻度肝炎[18]。有研究甚至发现在超过90%的EBV感染相关IM病例中合并肝脏受累[19],但通常是短暂性、轻度和自限性的,或仅通过支持治疗即可控制,极少数病例合并由感染引起的严重或致命性肝炎,但多在免疫功能低下的病例中出现,提示其发病与免疫反应的相关性[20-21]。本研究结果显示,IM患儿的CD3+T细胞比率与肝功能指标ALT及AST、CD3+CD4+T细胞比率与AST均呈正相关,提示IM患儿很可能由于CD3+T淋巴细胞的过度激活造成肝损伤,并由于机体的整体免疫失衡状态加剧肝损伤状态。临床诊疗过程中应对该方面进行密切关注,以避免IM患儿预后不良。

综上所述,IM患儿的病毒载量及外周血T淋巴细胞亚群分布特征可作为表征或预测肝损伤的指征,对于临床检测结果为高病毒载量、高CD3+T淋巴细胞水平的患儿应密切监测肝功能,并及时采取干预措施以降低患儿肝损伤的概率。本研究局限性在于收集病例周期短、样本量较小,仅在肝功能损伤指征方面提出初步研究思路,在进一步研究中,会继续加大样本量、延长观察周期,以获取更准确的结论。