微波辅助酸水解-HPLC测定紫肉甘薯中矢车菊素和芍药素的含量

孙皓熠，孙敬勇，姚庆强

（山东第一医科大学 药学与制药科学学院，山东省医学科学院 药物研究所，山东 济南 250117）

紫肉甘薯（purple sweet potato）是栽培甘薯中一个具有独特遗传性状和经济价值的特色品种类型，因其块根富含花青素（cyanidin），块肉呈深紫色而得名[1]。国内学者称其为紫心甘薯[2]或紫肉甘薯[3]。紫肉甘薯除了具有普通甘薯的生理保健功能外，还因其富含花色苷而具有许多重要的保健药用价值。多方面研究表明，花色苷具有抗氧化活性，能清除体内产生有害物质的氧自由基；具有抗突变活性及抑菌、杀菌、抑制肿瘤活性；还具有防止血管紧张、恢复正常血压，防止肝组织缺血、恢复肝功能正常及改善记忆等功能；还可用于放射防护等，且对人体没有任何副作用[4-5]。

紫肉甘薯块根中的花色苷有十几种之多，主要组分均为矢车菊素和芍药素，是由矢车菊素和芍药素被槐糖和葡萄糖糖基化后再被咖啡酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸酰基化演变而来，两者占其含量的90 %以上。由于紫肉甘薯色素成苷方式和酰基化的多样性，采用色谱法直接测定需要复杂的仪器和多种标准品，成本昂贵[6-9]。通过水解多种花色苷为少数花青素单体，可方便准确地对花青素进行定量分析，从而降低检测成本，简化检测步骤，但水解条件大多比较剧烈[10-12]，以致影响测定结果的准确性。

与传统水解提取方法相比，微波辅助法具有快速高效、活性成分提取率高、适于热不稳定性物质的提取及溶剂消耗少等优点[13]。本研究利用微波辅助酸水解法在常温条件下快速提取紫肉甘薯中花青素，再直接将花色苷水解为花青素，并采用高效液相色谱（HPLC）对矢车菊素和芍药素两种成分进行了定量分析，以冀为紫肉甘薯资源的合理利用与质量控制提供更为准确和全面的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 600色谱泵，Waters 2487紫外检测器，Waters 717自动进样器（美国Waters公司）；METTLER AE240电子天平；紫外分光光度计岛津UV-2201（日本岛津）；Discover 2.0聚焦单模微波合成仪（美国CEM）；ZYUPH-I-10T超纯水仪（四川卓越）。

1.2 试药

10批紫肉甘薯采购来源见表1。经山东中医药大学高德民教授鉴定为旋花科植物甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam]的干燥块根。矢车菊素和芍药素对照品（百灵威，经二极管阵列检测器进行峰纯度检测，均为单一成分峰，面积归一化法计算其纯度大于99.0 %）；色谱用超纯水（自制）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA/天地化学试剂）；三氟乙酸（分析纯，北京伊诺凯）；盐酸（分析纯，山东德康）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 分别精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的矢车菊素对照品9.0 mg和芍药素对照品20.4 mg，置入50 ml量瓶，加盐酸甲醇（3→10）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（浓度分别为0.18 mg/ml和0.408 mg/ml）。再分别精密量取上述对照品储备液5 ml，置100 ml量瓶中，加盐酸甲醇（3→10）稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（浓度分别为9.0 μg/ml和20.4 μg/ml）。

2.1.2 供试品溶液 取干燥的紫肉甘薯粉末（过100目筛）约1.0 g，精密称定，置入100 ml反应瓶中，精密加入盐酸甲醇溶液（3→10）20 ml，称定重量，40 ℃微波水解，功率500 W，时间20 min，取出，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液（80:20）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长538 nm，柱温25 ℃，进样量10 μl。矢车菊素和芍药素的理论塔板数均大于5000，与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，色谱图见图1。

图1 对照品和样品HPLC图谱

2.3 线性关系考察

分别精密吸取矢车菊素对照品溶液（浓度为9.0 μg/ml）和芍药素对照品溶液（浓度为20.4 μg/ml）5，10，15，20，25 μl，按2.2项色谱条件测定，以峰面积和进样量（μg）分别为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。矢车菊素回归方程：Y=2 879 711.1X+2889.4，r=0.9998；芍药素回归方程：Y=2 485 421.6X+7643.2，r=0.9997。结果表明，矢车菊素进样量在0.045～0.225 μg，芍药素进样量在0.102～0.510 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.4 精密度试验

取2.1.1项下对照品溶液，连续进样测定6次，每次10 μl，并记录峰面积。结果显示矢车菊素峰面积的RSD为0.14 %（n=6），芍药素峰面积的RSD为0.11 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取2.1.2项下供试品溶液，分别在0，2，4，6，8 h精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，并记录峰面积，结果矢车菊素峰面积的RSD为0.36 %（n=5），芍药素峰面积的RSD为0.32 %（n=5），表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.6 重复性试验

取同一批紫肉甘薯（批号为6）粉末6份，每份约1.0 g，精密称定，按2.1.2项方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪进行测定。测得矢车菊素的平均含量为0.52 mg/g，RSD为2.0 %（n=6）；芍药素的平均含量为1.23 mg/g，RSD为1.5 %（n=6）。表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收试验

取已知含量的紫肉甘薯粉末（批号：6，矢车菊素含量为0.52 mg/g，芍药素含量为1.23 mg/g）6份，各约0.5 g，精密称定，置入100 ml反应瓶中，分别精密加入车菊素对照品储备液和芍药素对照品储备液（浓度分别为0.18 mg/ml和0.408 mg/ml）各1.0，1.5，2.0 ml，再分别精密加入盐酸甲醇（3→10）19.0，18.5，18.0 ml，按2.1.2项方法制备供试溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪进行测定，计算回收率。矢车菊素的平均回收率为98.6 %，RSD为0.88 %（n=6）；芍药素平均回收率为98.8 %，RSD为1.2 %（n=6）。

2.8 样品含量测定

取10批不同单位提供的紫肉甘薯样品，分别按2.1.2项方法制备供试品溶液，按2.2项色谱条件测定，测定结果见表1。

表1 矢车菊素及芍药素含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液处理方法的选择与优化

试验考察了盐酸浓度、微波功率、水解时间及水解温度等条件对水解效率的影响，发现当采用（3→10）盐酸甲醇溶液、微波功率为500 W、微波水解时间20 min、水解温度40 ℃条件水解时，测得的矢车菊素和芍药素含量均最高，且水解产物中的杂质无干扰。

3.2 洗脱条件的选择

试验比较了甲醇-水、甲醇-0.1 %磷酸水溶液、甲醇-0.1 %三氟乙酸水溶液、乙腈-0.1 %醋酸水溶液、乙腈-0.1 %磷酸水溶液及乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液的洗脱效果，结果发现当以乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液洗脱时，所得色谱峰对称性好，能达到基线分离，因此将乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液（80:20）做为流动相。

4 小结

建立了一种用盐酸甲醇（3→10）微波水解-HPLC同时检测紫肉甘薯中矢车菊素和芍药素含量的方法，规避了传统酸方法水解时间长、温度高、花色素在水解过程中不稳定的技术难题。

本试验测定了山东地区的10个批次的紫肉甘薯中矢车菊素和芍药素的含量，10个批次的HPLC图谱基本一致，但不同批次矢车菊素和芍药素的含量有差异。综上，该方法简便、准确可靠、重复性强，为紫肉甘薯资源的合理利用与质量控制提供了更为准确和全面的参考依据。